生物钟基因period3的多态性及其与睡眠关系的研究进展

1、生物钟基因period3的多态性及其与睡眠关系的研究进展摘要：昼夜节律是大部分原核生物和所有真核生物具有的生物节律。period3基因是生物钟的核心组成，与睡眠生理密切相关。本文对 period3基因的功能研究 进展进行综述。关键词：period3基因，遗传多态性，串联重复多态性，昼夜节律，生物钟Advances in the Biological Clock GenePeriod3 Polymorphism and Relationship with SleepAbstract:Circadian rhythm is one of the most obvious character of

2、most prokaryotes and eukaryotes.Period3 （ per3 ） is a core component of the circadian clock genes, which are closely associated with sleep physiology. In this paper, the progress ofper3 gene function is reviewed.Key Word : period3 gene, genetic polymorphism, variable number tandem repeat （VNTR）, cir

3、cadian rhythm, bio-clock睡眠为维持正常生理活动所必需。人类的睡眠活动受到一系列因素综合调 节，包括外界因素和机体自身调节机制。外界因素包括光照、温度等；机体自身 的调节则包括两个相对独立又互相联系的调节机制，昼夜节律和睡眠平衡。昼夜节律又称生物钟，是周期约为24小时的生理过程；即使在缺乏外界因 素的条件下，如光照和温度等，昼夜节律仍能维持原有的生理周期1。从光合原核生物到高等真核生物，昼夜节律广泛存在。昼夜节律的标志是机体核心温度和 血浆中皮质醇和褪黑素的水平。哺乳动物生物钟的调节中枢位于下丘脑的视交叉 上核（suprachiasmatic nuclei, SCN ,通

4、过一系列的级联反应，使大脑与全身各个 部位的节律趋于一致2。在分子水平，昼夜节律是通过高度保守的转录水平反馈环路进行调控的， 因此转录因子在昼夜节律调控方面发挥了重要的作用。昼夜节律的核心基因包括 clock、bmal1、npas2、per1-3 和 cry1-2。转录激活因子 BMAL1 与 CLOCK 者B具 有bHLH-PAS结构，二者能形成异二聚体结合在靶基因启动子区域的顺式元件 E-box上，从而启动靶基因转录。二者的靶基因包括： period （在哺乳动物中， 包括per1-3）和crytochrome （包括cry1和cry2）,以及占转录总量约 8%-10%的“时钟控制基因 (

5、clock-controlled genes, CCGs)。细胞浆中的PER蛋白与CRY 蛋白能形成异源复合体，并转位至细胞核中，并与 BMAL1-CLOCK蛋白复合体 相互作用，进而抑制转录过程的进行；当 PER-CRY蛋白复合体逐步降解后， BMAL1-CLOCK蛋白复合体逐步恢复转录活性，从而形成负反馈调节环路。在 转录水平以外，这一环路同时还受到转录后水平的调节。一系列蛋白激酶以及蛋 白酶体降解机制，包括 E3连接酶和FBXL3,这些都能通过调节 PERs/CRYs在 mRNA和蛋白水平的稳定性，使PERs/CRYs的蛋白水平和细胞定位发生周期性 变化，从而影响昼夜节律的周期。在负反馈

6、调节环路和多种次级调节环路的综合 作用下，昼夜节律的周期维持在约 24小时3。per家族基因是生物钟调节的核心基因。1971年Konopka和Benzer首次报 道在果蝇中发现调节节律的基因，命名为period基因；而后在小鼠和人类中也发现了相似的基因。在哺乳动物中，per家族基因包括per1、per2和per3。利用 基因敲除小鼠模型研究功能时发现，在pen、per2、cry1和cry2这四个基因中，仅存在任意一个基因即可以维持昼夜节律；与此相对，在 per1/per2双敲除小鼠 模型中，仅PER3蛋白存在不足以维持昼夜节律。同时 per3/小鼠的昼夜节律相 关标志与野生型小鼠相比较并没有明

7、显变化4。因此认为，per3并不是昼夜节律 调节中的核心成分，其在昼夜节律形成中的作用机制并未明确。随着对per3功能研究的深入，人们逐步了解其在昼夜节律中的作用。由于 前期对生物节律的研究集中在依赖于视交叉上核的行为以及对光线的反应，尽管视交叉上核是控制哺乳动物自身节律的中枢， 但其并非唯一具有自身节律的器官， 肾上腺、肝脏、视网膜在体外均表现出自身节律。Pendergas年人利用per1-Luc的报告系统在体外检测不同器官的自身节律时发现，虽然在检测由视交叉上核控制的运动活力时per3/小鼠于野生小鼠没有显著差别；但是 PER3蛋白失去功能 时，小鼠的下丘脑和肺的自身节律出现变化，提示PE

8、R3可能参与其他器官自身节律的调节5。该课题组进一步利用per2-Luc报告基因系统，在体内进一步证实 per3对视交叉上核、肾脏、胸腺、弓状体和脾等器官的自身节律没有显著影响，但在per3失活后，小鼠的垂体、肝、肾、食管和主动脉的自身周期缩短。提示 per3对不同器官的节律存在不同的调节作用60止匕外，睡眠稳态平衡是调节睡眠的另一个重要因素。最初对睡眠平衡的研 究来自于发现：在睡眠剥夺后，机体需要的睡眠增加以进行补偿，从而形成一种平 衡机制。睡眠平衡的标志是脑电图(electroencephalogram,EEG )的Delta波活动 (Delta Activity),或慢波睡眠活动，检测脑

9、电图Delta波活动可以评估维持睡眠平 衡的需要7。维持睡眠平衡的分子基础仍未明确。per3对睡眠的影响Hasarl8等人报道，per3参与睡眠-清醒时间以及睡眠平衡的调节。利用per3 基因敲除小鼠作用为研究模型，发现在暗周期时对小鼠进行睡眠干扰，野生型小鼠的运动活力显著下降，而per3-/-小鼠运动活力的下降程度显著低于野生型小鼠， 与npas#小鼠的表型相类似。在以 24小时为周期的基准水平上，per3-/-小鼠与 野生型小鼠没有显著差别，但在暗周期中per3/小鼠的快速动眼期睡眠(RapidEye Movement Sleep, REM)时间减少；在暗周期开始和结束时 per3-/-小

10、鼠表现出 更高的EEG Delta波活动。睡眠剥夺(Sleep Deprivation, SD)后，per3-/-小鼠表 现出更高的非快速动眼期睡眠(Non-Rapid Eye Movement Sleep, non-REM|)的需 求，EEG的Delta波活动升高；与此相对，在睡眠剥夺后的恢复期，代表 REM 的Theta波活动降低。这表明虽然 per3不是昼夜节律调节的核心组分，但其通 过参与清醒活力与睡眠平衡的调节，进一步对机体睡眠产生影响。per3表达变化对人类睡眠的影响亦有报道。与年轻人向比较，大部分老年 人的入睡和清醒时间更早，较难维持睡眠并且更容易受到环境的影响。Hida9等人研

11、究了老年人外周单核细胞中 perl、per2和per3表达变化发现，和年轻人 (8个不同群体人群，平均年龄 21岁)的表达水平相比较，老年人(6个不同 群体人群，平均年龄62岁)的外周单核细胞中perl和per2的表达没有显著变 化；而per3的表达则出现变化：per3表达达到谷值的时间提前，而达到峰值的 时间则延迟。同时研究结果显示，老年人褪黑素分泌周期略有提前，提示 per3 表达的变化可能与老年人下降的睡眠动力(homostatic sleep drive有关。per3基因多态性研究进展人类的per3基因位于染色体1p36,基因长60475bp, mRNA长6203bp, 共编码1201

12、个氨基酸，共21个外显子。在第18个外显子区域存在4个或5个 串联重复序列(Variable Number Tandem Repeat VNTR ),每个 VNTR 编码 18 个氨基酸。这一区域存在一系列预测的磷酸化位点，因此 per3基因的VNTR多 态性与人日常的昼行偏好、大脑皮质区活力以及认知水平等相关。根据 per3等 位基因VNTR的数目，人类存在per34/4(具有4个VNTR),和per35/5 (具有5个 VNTR)两种纯合个体，以及per34/5的杂合个体。不同人群中per3 VNTR分布频率不尽相同。Nadkarni10等人统计了全球范 围内不同人群的per34等位基因的

13、分布频率，北非及西亚、南亚地区(阿尔及利 亚、北苏丹、也门、印度)的频率最低，为 0.5至0.6;东亚地区(蒙古、中国 四川、日本)的频率最高，为 0.8至0.9。Ciarleglio11等人选取全球范围内，非 裔美国人、欧裔美国人、非洲加纳、中国汉族、巴布亚新几内亚五个不同人群的 样本，分析clock、per2、per3等节律基因多态性的分布情况时发现，中国汉族 样本中per34等位基因分布频率最高，为0.81,其余组样本分布频率介于0.41至 0.66之间，提示中国人群per3 VNTR分布与其他族群有显著不同。安怀杰等鉴 定了汉族人群中，per34/4、per34/5、per35/5三种

14、基因型分布频率分别为 78.33%、 20%和1.67%,表明汉族人大多数基因型为 per34/4。per3 VNTR多态性对睡眠生理及昼夜偏好的影响前期研究表明，per3 VNTR影响个人昼夜偏好：per35/5健康个体有日行偏 好，入睡等待时间较短；per34/4健康个体则有夜行偏好，入睡等待时间较长，与 睡眠延迟综合征(Delayed Sleep Phase Syndrome, DSPS)关12。在正常生理状态 下与per34/4个体相比，per35/5个体具有更多的慢波睡眠(Slow Wave Sleep,SWS) 与慢波睡眠活动(Slow Wave Activity , SWA)；在

15、清醒状态和REM时期的Theta 和Alpha活动也有增加13。已有不同研究组报道per3 VNTR多态性与个人昼夜偏好的关系。睡眠情况 会随着年龄增长有所改变，与年轻人相比，老年人清醒时间和次数延长、慢波睡眠时间较少，以及清醒时间提早。Viola等人比较不同per3基因型老年人的睡眠 差异时发现，per35/5纯合子褪黑素周期提前，并且更早到达褪黑素分泌顶点；同 时夜间更易清醒，在快速动眼期睡眠时脑电波Delta活动增加，前Sigma活动降低14。这些结果表明老年人群的昼夜节律和睡眠平衡同时受到per3 VNTR多态性调节。Kunorozva15等人则研究了非洲职业运动员中 per3 VNT

16、R和昼夜偏好的 关系，发现在自行车和跑步两类运动员中，日行偏好的比例均高于普通人对照组， 同时per35等位基因频率也更高，运动员的时间偏好与per3 VNTR多态性存在显 著关联。有研究调查了 432个挪威高校学生个体per3 VNTR数目与昼夜偏好的 关系，但没有发现两者存在关联，提示昼夜偏好可能受到多种因素的综合影响16per3 VNTR多态性对失眠的影响对不同基因型的健康志愿者进行睡眠剥夺实验后检测脑电图，在睡眠剥夺 后清醒时期，per35/5个体Sigma和Alpha活动上升更为迅速，REM睡眠和觉醒 时期Alpha活动显著增高。睡眠缺乏是现代社会普遍存在的现象，对睡眠平衡和认知能力

17、的影响显著。在长期部分睡眠不足的情况下，per35/5个体呈现出更高的 慢波睡眠活力、更高的睡眠平衡压力，因此有更高的睡眠需求；但在认知能力、 执行能力和主观睡意方面则与 per34/4个体没有显著区别17。另一项共19个志愿 者参与的小样本研究中，研究者们通过评价心理警觉、客观警觉、主观睡意几个 方面，发现per34/4个体在睡眠受限制（Sleep Restriction, SR的情况下表现出更 高的弹性；该研究结果提示 per3可能在睡眠限制的情况下参与机体自身稳态的 调节叫相当一部分（36%91%）酒精依赖者面临失眠的困扰，嗜酒者常表现出夜 行偏好。因此Brower等19调查了酒精依赖者

18、中失眠与per3 VNTR的关系。分别 问卷调查了失眠程度、人格特点、精神状态、童年受虐情况、酒精成瘾情况，并 分析per3 VNTR基因型，以研究per3 VNTR是否对酒精成瘾者的失眠情况存在 影响。调查发现，在酒精依赖者中，饮酒多少、身体与精神的健康程度，均与失 眠严重程度有关。值得注意的是，该调查发现，基因型为per34/4的酒精依赖者比per35/5依赖者具有更严重的失眠评分，提示在控制其他相关因素的前提下，per3VNTR有助于预测酒精依赖者的失眠程度。per3 VNTR多态性与睡眠的关系已被许多课题组证明，另一方面，基因多 态性并不局限于VNTR多态性，还存在其他基因水平的可遗传

19、变异，如单核甘 酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP5) 。 SNP是一种常见的可遗传变 异，指在基因水平上发生单个核甘酸的变异引起的DNA序列的多态性。SNP可能导致基因翻译产物的成分、构象等发生改变，从而可能导致不同的生物学结果。 SNP的分布具有特异性，不同人的 SNP分布不尽相同。Gu等20人通过对1250 个高加索人进行全基因组扫描，评价了约 250万个SNP位点与人体晨间血液中 褪黑素水平的关系，得到20个候选基因上1298个候选SNP位点。他们发现， per3与血清中褪黑素水平存在显著关联；在最为显著的SNP位点(SNP1-7763877 GT),血清褪黑素水平下降达到28%。Ojeda等21人通过对209个大学生筛查 基因组SNP,同时问卷调查其睡眠情况后统计发现，per3基因的一个非同义突变，rs2640909,与昼夜偏好有关。研究结合分析晨间复合尺度调查( Composite Scale of Morningness, CSM)与 SNP检测发现，rs2640909与 CSM 中的子量表“晨 问活动”密切相关；第一次发现这一 SNP与昼夜习性存在关联。per3 VNTR对光照敏感性的影响光对人类行为、警觉以及认知存在影响；除了可见光以外，不可见光对人 的