高通量测序最新进展

1、高通量测序最新进展综合不同的测序技术 进入 21 世纪后，以 Roche 454、Illumina Solexa 和 ABI SOLiD 为代 表的第二代测序技术诞生了，并迅速掀起了你追我赶的技术比拼高潮。 2010年，Illunima和ABI先后发布新款测序仪，改进了原有机型，测 序通量不断提升，测序成本不断降低，现在已经进入了数千美元测一 个人全基因组的时代。Roche 454 GS FLX Titanium每次运行能产生100万条序列，平均读长 能达到400nt，且第400个碱基的准确率能达到99%。一次运行所需 时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的序列信息。Illumina公司的第二

2、代测序仪最早由Solexa公司研发，利用其专利核 心技术DNA簇”和”可逆性末端终结(reversible terminator)，实现 自动化样本制备和大规模并行测序。Illumina公司于2007年初花费6 亿美金巨资收购了 Solexa。2010年初，Illumina将其第二代测序仪 Genome Analyzer IIx 升级到 HiSeq 2000。目前最新款SOLiD 5500 xl含有两张微流体芯片(microfluidicFlowChip),每张芯片含有6条相互独立的运行通道(run lane)。每 条lane都能运行相对独立的测序反应，这样的设计使得SOLiD 5500 xl

3、 测序平台极具灵活性。最大测序读长为75nt，同样支持Fragment, Pair-end和Mate-Paired文库。单次运行能得到的最大数据量为300Gb (使用最新设计的nanobeads)。测序的系统准确性能达到99.99%。技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界 也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基 因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基 础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序(resequencing)，在 全基因组水平上扫描并检测突变位

4、点，发现个体差异的分子基础。在 转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing)， 从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究；或 者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing)，通过分离特定大 小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组 水平上，与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区 域和基因组上的甲基化位点。第三代测序：Helicos 公司Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序

5、的思想，将待测序列随机打断成小 片段并在3末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表 面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA 合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上 一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。 用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭 过程完成测序。Heliscope的读取长度约为30-35 nt，每个循环的数据产出量为21-28 Gb。Pacific Bios

6、ciences 公司Pacific Biosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体 进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔L的厚度为100 nm 的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行 合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被 添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光， 根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间(毫 秒级)与它进入和离

7、开的时间(微秒级)相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与 合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链 之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物(fluoropolymer)切割并释放，荧光分子离开荧 光信号检测区。Oxford Nanopore Technologies 公司Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序的 技术。他们设计了一种以“溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊 精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环 糊精

8、相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱 基的特征。一、测序技术总结与展望第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物 种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而 且难以胜任微量DNA样品的测序工作。第二代测序技术中，454序列 片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在 判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa较454具有通量高、片 段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。Solexa双末端测序(paired-end sequencing)可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是

9、随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降， 而且在阅读AT区时有明显错误倾向。SOLiD基于双碱基编码系统的 纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特 别是SNP检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中 的广泛应用。第三代测序技术日前正在研发阶段，尚未正式投入使用。.则序方淮F平白公司公司网站方,酒洲序长度每个借M、们 数布产H吊口个福环耗时主要错误来源铝一代调序 技术DNA Analyzer.ppl iud EiQGystra.&* * ME i3.pp 1 ledhi os y a t eras, c cm膈FlMtl法1000 bp55 Kt第二代测序45

10、4/GS FIX Titamun. EeriesRc-ehe-ioch eappl iedso e nize. cam简辟醍测序法.取A累台配400 bp1D0-6C0 削10 hSoluxd/11) umino Uenoiije ibialyzcrIllunina ww. illuLina. cam边合剧边测序2*75 bp30; 5-25 Gb9.5 dSOLiD/SOLiD 3 sy steniAppl ied Eiasyst tn.sW A W |app 1 :l dbi s tcam连棱皱测序2*0 bpirf Gt6-7 d替我第三代焉序Hr1iscope/Helicos G-ea

11、etic Analysis Sjst?niHelio&sAiffl-. hj?licnshio. ccm纳合成边则序 .取A果含怖3CT35 bp21-2S Gb3 d5MRTFasificWTFW., pacif i cbiosc i ejices- 0031边合成边测1矽 加NA曜合SSlOOQOO bp钏*孔单分J-Oxford Knuopore Technolaeies 呼禹 nanopcirctech! czn电信兮网序无限长高通量是第二代和第三代测 序技术的共同特点。由于这些测 序技术一次可获得上百万条、甚 至几百万条序列信息，因此可对 某一组织、某一时间表达的所有 mRNA进行序

12、列测定，故又被称为 深度测序32。由于使用高通量测 序技术可以实现对不同组织mRNA 表达差异进行检测，通过与基因 组进行比较可以确定组织特异表 达的基因，因此具有取代“基因 芯片”技术的态势。由于基因 芯片的检测范围取决于芯片上探 针的信息，因此只能检测人们已 知序列的特征，缺乏发现寻找新 基因的能力，而高通量测序则能 够很好地弥补基因芯片这方面的 不足。但就目前而言，高通量测 序技术建立的时间还很短，技术 不是很成熟，其信息储备量也很 有限；而基因芯片技术已经发展 了近16年，其实验技术及后期数 据分析理论已经很成熟很完备， 也积累了庞大的公共数据库，因 此短时间内基因芯片技术还会占 据主

13、导优势。但相信在不久的将 来，高通量测序技术将会越来越 成熟并得到更加广泛的应用。Genome Analyzer技术的基本原理:文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头（adapter）。2.产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链 后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5或3）随机和附近的另外一个引物互补，也被固定”住，形成“桥 （bridge） “。反复30轮扩增，每个单分子得到了 1000倍扩增，成为 单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后 杂交在日标区域一侧的通用序

14、列上。3测序Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing BySynthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记 的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3羟基末端带有可化学 切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反 应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。 之后，将这些基团化学切割，恢复3端粘性，继续聚合第二个核苷酸。 如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计 每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。 日前的配对末端读长可达到2x50 bp，更长的读长也能实

15、现，但错误 率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记 的不完全切割。一,丫4叫也eFL1-3ATP-(blMki) + FL3-改妹 FL3qCTP-blg*) + FL4-dTTP-jblck&i)HutweSCenceif) four 亡h占M ChemrMiEly cleave labels and L -wwwe v 4.数据分析自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。Genome Analyzer系统之所以如此畅销，关键在于其技术上的优势。可扩展的超高通量Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质 过滤数据。这个技术的

16、可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用 更少的经费完成更复杂的项目。到今年底，通量还有望上升到95 GB， 相当于人类基因组的30倍覆盖度。需要样品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样 品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。这也是很多研究人 员所考虑的因素。简单、快速、自动化Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。即使是最 小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。制备样品 文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。Cluster Station可以说是Genome Analyzer的核心。由

17、独立软件控 制的自动生成DNA簇的过程可以在5小时之内（30分钟手工操作） 完成。这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR，减少了手工操 作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。快速的实验流 程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化步移降低了项目 的时间和费用。新颖的测序化学技术Genome Analyzer通过合成测序来支持大规模并行测序。利用新颖 的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基 掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然的竞 争减少了掺入的误差。单个或配对末端支持Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过 程简单，减少了样品分离和制备的时间。制备基因组DNA的单个片 段或配对末端文库需要6个小时，只有3个小时需要手工操作。2x50 个碱基或更长的读长增加了比对基因组的能力，并拓展了在其他方面 的应用。然而，精明的用户更看重的是性价比，这也是他们选择Illumina的重 要原因。川umina的售价约为45万美元，低于454 GS FLX的50万 和SOLiD系统的59万（以上皆为美国的售价）。此外，运行成本也 是一个关键因素。美国凤凰城翻译基因组学研究院（TGen）的主管 David Duggan曾表示，当年购买新一代测序仪时，每次运行的费用 就