三种酶活性测定

1、水体中碱性磷酸酶活性：对硝基苯磷酸二钠（pNpP, sigma公司），本实验 中所选择的反应条件为:pH8.4（用Tris缓冲溶液调）、温度30C、反应物体积5mL、 反应时间6h、波长4l0nm，岛津uv-2401分光光度计测定.A总的0.45um膜藻类0.2um细菌溶解性的物质6.Berman T Alkaline phosphatases and phosphorus availabilityin Lake Kinneret 19707.洪华生海水中碱性磷酸酶活力的测定及其在磷循环中的作用初探 1992(04)8.12.Chrost R J.Overback J. Kinetics of

2、 alkaline phosphataseacitivity and phosphorus availability for phytoplankton andbacterioplankton in lake Plu 8 see (North German Eutrophiclake) 1987(13)底泥中碱性磷酸酶（APA）M定方法AP（磷酸酶）催化无色底物0.1 %-对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）产生稳定的 黄色产物P-NP,在410 nm可见光下，通过测定P-NP的产生速率，即可换算出AP 活性APA.1.试剂NaOH: 4g NaOH 溶于 100mL H2O 中对硝基苯磷酸二钠（p

3、-NPP） : 6.75gp-NPP溶于水中，并稀释至1000ml.（1ml含 25mg 酚）底物混合液：1ml p-NPP百倍母液+99ml tris-HClTris-HCl缓冲溶液：1g Tris中加入2.061ml浓HCl,用水定容至1000mL，溶液 的pH为8.5对硝基苯酚储备液（1g/L）：1g对硝基苯酚溶于蒸馏水中并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中.标线制备（辛承友2004）对硝基苯酚使用液（10mg/L即1ml含10ug酚）：10ml对硝基苯酚储备液用缓冲 液稀释定容到1000ml容量瓶中分别取0,1,2,3,4,5ml对硝基苯酚使用液于10ml EP管内，分别加缓冲液

4、5,4,3,2,1,0ml（对硝基苯酚浓度分别为 0,2,4,6,8,10mg/L）加入 0.5ml NaOH离心 5000 转,10min离心后取上清，以水为参比,410nm比色实验组向 EP 管内加入 0.1g sediment （2ml water）加底物混合液5ml30oC 6h（摇床上振荡恒温培养）加 NaOH 0.5ml,离心 5000 转,10min以水为参比,410nm测吸光度对照组向 EP 管内加入 0.1g sediment加NaOH 0.5ml，加底物混合液5ml30oC 6h（摇床上振荡恒温培养）离心 5000 转，10min以水为参比,410nm测吸光度对照组和实验组

5、同时进行，标线制备一次即可底泥或水样零下20度保存底泥中脱氢酶(DHA)测定采用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)为基质经脱 氢酶催化还原反应后生成红色产物(TTCH2-trifenylformazane，TpF)，丙酮萃取。采用分光光 度计于485nm波长处测定其吸光值，根据标线计算出TpF生成量来表示DHA。依次加人Tris-HCl缓冲溶液1.5 mL、0.l mol/L葡萄糖溶液、0.4 % TTC溶液和0.36 % Na2SO3溶液各0.5 mL,置于37 C恒 温水浴振荡仪中培养2 h后取出，加人0.

6、5 mL甲醛终止反应，准确加人5 mL丙酮，37 C振荡萃取10 min,在3000 r/min的条 件下离心5 min，492 nm处测定吸光度。在上述条件下，l h产生1 散F的量为一个酶活力单位。底泥预处理：取底泥0.2g sediment于EP管中，用蒸馏水振荡混合后，5000 r/min离心5 min，弃去上清液，如上方法洗涤三次1.试剂0.36%硫酸钠溶液：0.36g硫酸钠用水定容至1000mlTF储备液：称取30mgTF用定溶于50mL棕色容量瓶中，此溶液即为l g/L TF 的标准溶液Tris-HCl 缓冲液(pH = 8.4)： 称取 6.037g Tris，加入 20mL

7、1mol/L HCl,再定容 至 1000mL甲醛丙酮0.4%TTC溶液：取0.4gTTC溶于Tris-HCl缓冲液定容至1000mL，贮存于棕色瓶底物混合液 TTC: Tris-HCL=1:3标线制备(周春生1996)TF储备液：称取50mgTF定溶于50mL茶色容量瓶中，此溶液即为l g/L TF 的标准溶液.TF梯度溶液：分别吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7mlTF标准储备液，定容至 5ml，即配成浓度分别为 0、20、40、60、80、100、120、140 g/mL TF 系列溶 液.绘制TF浓度对应吸光值的曲线.实验组0.2g sediment +4m

8、l底物混合液+1ml硫酸钠+1ml水37oC 2h (摇床振荡培养)2ml甲醛离心 5000r/min，5min 弃上清，加丙酮5ml(丙酮挥发，加盖处理)37 oC振荡萃取10min离心5min取上清485nm比色对照组0.2g sediment +4ml底物混合液+1ml硫酸钠+1ml水2ml甲醛37oC 2h (摇床振荡培养)离心5000g 5min弃上清加丙酮5ml(丙酮挥发，加盖处理)37 oC振荡萃取10minG-离心 5min (5000r/min)，取上清 485nm 比色对照组和实验组同时进行，标线制备一次即可底泥中脲酶（Urease）测定试剂配制水本实验均指无氨蒸馏水，蒸馏

9、水煮沸ih即可纳氏试剂测定氨氮含量，详见水样氨氮分析方法柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）： 184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。底物混合液尿素溶液:缓冲液=1:21.标线制备吸取0,0.05,0.1,0.3,0.5,0.7,0.9和1mL氨氮标准液（10mg/l）于EP管中，分别加水5,4.85,4.9,4.7,4.5,4.3,4.1,4ml加0.1ml酒石酸钾溶液，混匀.加0.15ml纳氏试剂,混匀.静置5min，在波长410nm处测定吸光度.2实验组0.2 g sediment +4 ml底物混合液（尿素）37oC 24 h加 0.5ml NaOH离心 5000r/min, 10 min取上清3 ml至一新EP管，加水2ml加0.1mL酒石酸钾钠溶液，混匀,加0.15 ml纳氏试剂，混匀静置5 min后,410 nm处测定