蛋白表达以及纯化

1、关于蛋白表达及纯化第一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Part 1: 蛋白表达、纯化第二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月蛋白表达流程目的基因cDNA表达宿主载体设计引物连接转化 诱导表达蛋白纯化鉴定保存第三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月gene第四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Cell-freeBacterialYeastInsectMammalianHost第五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Expression System CharacteristicsCharacteristicsE. coliYeastInsectMammalia

2、ndoubling timerapid (30 min)rapid (90 min)slow (18-24 hrs)slow (24 hrs)cost of growth mediumlowlowhighhighexpression levelhighlow high low high low moderate protein foldingrefolding may be requiredrefolding may be requiredproper foldingproper foldingN-linked glycos.nohigh mannosesimple, no sialic ac

3、idcomplexO-linked glycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationno yesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesproject costlowlowmiddlehigh第六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月一：大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核

4、生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)第七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Vector第八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月二 大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：复制起点(ori)多克隆位点。筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记）控制和调节转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达, 它的编码结构必须是连续的, 不间断的, 处于寄主启动子有效控制下。第九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1 ) 强启动

5、子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10% - 30%以上2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平3 ) 应该是诱导型的, 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。常用的大肠杆菌表达载体启动子： 噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta内酰胺酶启动子启动子第十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月终止子a: 如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底

6、水平。c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强第十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月转译起始序列a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主要因素。b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列。c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)第十二

7、张，PPT共五十二页，创作于2022年6月筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导入寄主细胞同任何一种目的启动子连接 , 其表达活性可作为检测启动子功能的依据。半乳糖苷酶基因lacZ 荧光素酶基因 (luciferase )基因、半乳糖激酶基因(galK )氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat )四环素抗性基因 (tetr )Tag-第十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月第十四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基第十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月X gene引物的设计

8、：设计一对特异性引物。上游、下游引物引入酶切位点oligo6RNA提取：TRNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNA marker；2：X 基因扩增产物图1.1 X基因的RT-PCR扩增产物第十六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Gene cloningYour destination vectorR1R2Your linearized vectorX基因R1R2+1. 双酶切目的基因和载体及切胶回收：附件目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基2. 连接转化：附件3. 双酶切鉴定：附件4. 测序：附件1：DNA marker; 2：重组质粒pET28-X双酶切; 3：空质粒pET

9、28a双酶切图1.3 重组质粒pET28-X双酶切鉴定图1.4 X基因发生点突变(AGUAGC)，但为同义突变（Ser ）第十七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Protein expression 检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达，并确定在不同IPTG浓度和时间蛋白诱导效率的差异。挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。37C，1mM IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD6000.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD6000.4-

10、0.6约需2h）时加入终浓度为1mM的IPTG。诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液OD600100l的比例(如1ml OD600为0.4的菌加40ul buffer)加入2上样缓冲液，混匀，-20保存或直接上样。根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS胶。（50KD蛋白10或12）诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2上样缓冲液，vortex。将收集的菌液在水中煮5min，上样10l ，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液

11、若是新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。第十八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月IPTG inductionEven in the absence of IPTG, there is some expression of T7 RNA polymerase from the lacUV5 promoter.The degree of toxicity will vary from protein to protein. pET system manual, Novagen, 11th Edition第十九张，PPT

12、共五十二页，创作于2022年6月1：蛋白marker；29：分别用IPTG 诱导表达0、1、 2、3、4、6、8、12 h。图1.6 X蛋白表达条件：诱导时间优化1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L；4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L；7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化第二十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Protein PurificationCharacterize function, acti

13、vity, structureUse in assaysRaise antibodiesmany other reasons . 第二十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Guidelines for protein purificationDefine objectivesDefine properties of target protein and critical contaminantsMinimize the number of stepsUse a different technique at each stepDevelop analytical assaysAdapte

14、d from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC第二十二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Basic scheme of protein purificationFrom: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC第二十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Protein preparation, extraction, clarificationCell

15、 growth, protein over-expressionCell lysisRemoval of cell debrisFrom: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC第二十四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Protein isolation, concentration, and stabilizationReversible precipitation with salt or organic moleculesFrom: Protein Purificati

16、on Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC第二十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Fractional precipitation of proteinsAdd Precipitant, CentrifugationChromatographyPrecipitate contaminantsPrecipitate protein of interestDiscard supernatant, Resuspend proteinDiscard pelletAdd Precipitant, Centrifugatio

17、n, Discard supernatant, Resuspend protein第二十六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Intermediate PurificationLiquid chromatography (lower resolution, lower cost)From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC第二十七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月An introduction to liquid chromatographyProtein sol

18、ution applied to a columnColumn = solid porous matrix (stationary phase) + liquid (mobile phase)Proteins separated based on differing interactions with stationary and mobile phasesMobile phase conditions can be adjusted to increase or decrease affinity of protein for stationary phase (gradient)第二十八张

19、，PPT共五十二页，创作于2022年6月Size exclusion chromatographyBigger ProteinsSmaller Proteins第二十九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Affinity Chromatography第三十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Affinity ChromatographyMost commonly-used chromatography techniqueCan be used on protein with natural ligandsOften involves covalent attachment of a

20、ffinity tag to protein Because of unique tag, provides rapid, specific cleanup in one chromatography step*Can allow for automation of protein purification第三十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Popular Small Affinity TagsTagMatrixEluting AgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA, Talon, Cobaltimidazole or low pH5-15HH

21、HHHnative or denaturing; inexpensive resinFLAGanti-FLAG antibodylow pH or EDTA/EGTA8DYKDDDDKhigh specificity; harsh elution cond.Strep IImodified streptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensive resinS-peptideS-proteinenzymatic cleavage15KETAAAKFERHMDSdetection possible; expensive resin第三十二张，PPT共五十二页，创作于

22、2022年6月Popular Large Affinity TagsTagMatrixEluting AgentSizeNotesMBPamylosemaltose40 kDasolubility + secretion enhancer; inexpensive resinGSTglutathionereduced glutathione26 kDainexpensive resincellulose-binding domainscellulosewater or GdHCl4-20 kDasecretion enhancercalmodulin-binding peptidecalmod

23、ulinEDTA/EGTA4 kDadetection possible; expensive resinHis-patch thioredoxinNi2+-NTA, Talonimidazole11.7 kDasolubility + S-S enhancer第三十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月镍柱亲和层析详细步骤：附件第三十四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月1：空质粒未诱导；2：空质粒IPTG诱导；3：细菌裂解液上清（可溶部分）；4：细菌裂解液沉淀（不可溶部分）；(B) 切胶回收 1：蛋白marker ；2：重组质粒未诱导；3：重组质粒IPTG诱导；4：空白孔； 5

24、：纯化重组蛋白； (C) Ni柱亲和层析：1-8为依次的蛋白过柱洗脱液图1.7 X蛋白的可溶性分析(A)和纯化(B、C)蛋白纯化结果1.亲和层析柱2.切胶回收（附件）可溶性蛋白 or包涵体纯化第三十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Polishing stepsFrom: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition ACLiquid chromatography (higher resolution, higher cost)第三十六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Basi

25、c scheme of protein purificationLiquid chromatography (higher resolution, higher cost)Liquid chromatography (lower resolution, lower cost)Reversible precipitation with salt or organic moleculesCell growth, protein over-expressionCell lysisRemoval of cell debrisFrom: Protein Purification Handbook. Am

26、ersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC第三十七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Tag RemovalNH2proteintaglinkerDDDDKproteaseconsiderations:effect on structureeffect on functionflexibilityprotein 1 sequence Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins

27、 Protein Expression and PurificationVolume 48, Issue 1, July 2006, Pages 1-13 第三十八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Protein detection methodsSDSVisual confirmationWestern blotUV SpectrophotometryAbsorbance 280 nmDue mostly to TrpProtein calculated with Beers LawColorimetric TechniquesColor change proportional to

28、 proteinBradford, Lowry, BCAJ.S.C. Olson and John Markwell. Current Protocols in Protein Science (2007) 3.4.1-3.4.291：未加IPTG诱导的重组质粒；2：IPTG 诱导的重组质粒；3：空白孔；4： 纯化后的重组蛋白图1.8 重组蛋白的Western blot 分析26kDa1243Anti-6His antibody第三十九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Final steps in purificationCheck purity by detection method

29、sConcentrate your proteinPrecipitationCentriconsSmall column with high binding capacityChoose a storage buffer and storage conditionsConsider intended use of proteinStabilizing additivesFlash freeze protein and store at -80o CConfirm identity of purified proteinMass spectrometrysequencingAnalytical

30、assays第四十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Helpful references and guides附件：Protein_Expression_Protocol_3th.docpET system manual, Novagen, 11th EditionAmersham Biosciences “Protein purification handbook.” 18-1132-29, Edition AC. Go to following URL and download pdf of Protein Purification Handbook:Affinity Purifi

31、cation: Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G.E., Pedersen, J. Prot. Expr. Purif. 48 (2006) 1-13.J.S.C. Olson and John Markwell. Current Protocols in Protein Science (2007) 3.4.1-3.4.29第四十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Part 2：抗体制备、应用第四十二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月单抗制备多抗制备：附件抗体鉴定效价特异性第四十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Principle of McAb Production第四十四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月抗原经FCA或FIA充分乳化后免疫家兔。首次免疫佐剂用FCA，第二、三次用FIA。家兔脊柱两旁选5点皮下注射，每点注摄0.2ml， 间隔后2周选不同点注射，每次免疫的抗原量约 350g/兔。第三次免疫后10天，耳动脉取血检测抗体效价。双相琼脂扩散实验效价至少达到1:16；ELISA效 价