染色体与DNA复制

1、2.3 DNA的复制12.3.1 DNA的半保留复制机理 1、半保留复制的模型和验证 模型假设：有三种可能半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。2验证半保留复制的实验1958年Meselson-Stahl实验 32.3.2 复制的起点方向和速度 复制结构-复制叉复制子（replicon) 通常把生物体的复制单位称为-45 复制的方向-单向、双向1、 E.coli定点、双向对称复制。2、T7在近一端的17处开始，向两端延伸。3、枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。4、

2、质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组进行时双向复制。5、质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。6、mt DNA进行D（displaced loop）环复制7、真核有多个复制起点（i），双向等速复制。6举例：大肠杆菌复制起始点复制速度72.3.3 复制的几种主要方式虽然DNA 均以半保留进行复制，但因DNA在细胞内的存在形式不同，复制叉部位复制方式也不同。主要有：1、线性双链DNA2、环状双链DNA8 2.3.3.1 线性DNA双链的复制线性DNA的末端序列的合成，可能是完全独立的过程。目前有4种假设：1、线性DNA的转变为环形。2、线性DNA的末端形成发夹结构。3、末端加头或

3、接尾。4、与蛋白质结合引发合成。9举例：腺病毒DNA的复制腺病毒DNA全长35937 bp线性双链，两端各有反向重复顺序103162 bp，两末端各有50 bp为复制起点。其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。10腺病毒新DNA链合成-蛋白质引物11 2.3.3.2 环状DNA双链复制依环型DNA的复制过程中间物结构有3种：1、型复制2、滚环式复制（型复制）3、D型复制 121、型复制模式双向复制13E.coli 3H-T培养物与放射自显影实验14 2、滚环复制模型 1968年Gilbert提出，要点（1）共价延伸；（2）模板链和新

4、合成的链 分开;（3）不需RNA引物，在正 链3OH上延（4）只有一个复制叉;（5）形成多联（concatemer ）;15 滚环复制的电镜照片16。滚环复制模式173、D环复制模式 单向复制一种特殊形式18三种DNA复制的特征对比 中间物结构 模板 方向1、型复制 型 双链环状分子两条链 双向2、型复制 型 双链环状分子一条链 单向3、D型复制 D型 双链环状分子两条链 单向192.4 原核生物和真核生物 DNA复制的特点2.4.1 原核生物DNA复制的特点 以大肠杆菌基因组DNA复制为例： 基因组DNA为双链双向型等速复制20 E.coli双链复制的起始1、主要发生oriC区域。2、在or

5、iC序列上(245bp)进行复制起始，由形成引发复合物开始，需要6种蛋白质装配成复合物，使环状超螺旋摸板转变为双链广泛解旋的形式。反应是在9kb和13kb的重复序列上。3、DnaA首先结合在oriC序列的4个9kb重复序列上。然后 DnaA作用于3个13kb重复序列，使这几个位点的DNA融化解链，形成开放复合物。4、前引发复合物能是DNA oriC区域解链约60bp，在 oriC区域终止，并引发一段RNA引物。21复制起始点解链22复制起始区的结构特点（1）富含AT，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（914个GATC） 8个GATC较保守,CATC中的“ A”已甲基化;

6、（3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的RNA；起转录激活作用。232.4.1.1 DNA双螺旋的解链 复制时，DNA双链解开形成复制叉。此过程有许多蛋白质和酶参与完成。 重要的酶和蛋白质有：（1）单链结合蛋白（SSB）（2）DNA解链酶（DNA helicase)（3）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)24 单链结合蛋白SSB （single-strand binding protein)又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing prote

7、in） 由177个aa组成，在E.coli 中以四聚存在,分子量为74KDa。在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。25 DNA解螺旋酶解螺旋酶是拓扑异构酶型酶。具有ATPase活性，催化DNA解链，放松负超螺旋。有两类：一是在滞后链解螺旋酶二是在前导链解螺旋酶262728 解旋酶(helicase)29复制叉移动带来的拓扑学问题30 旋转酶引入负超螺旋的模型312.4.1.2 DNA复制的引发 引发酶（primase)：一种特殊的RNA聚合酶 引物：RNA片段 引发体：6种蛋白质（n,n,nDnaB,C)和I

8、共同组成 引发过程：前导链引发 后随链引发 32 RNA引物引物酶催化合成RNA引物。不同生物RNA引物长度不同。 原核生物：174和 E.coli为2-5b 真核生物： 5-10b M13、G4： 20-30b33 引物酶与RNA聚合酶引物酶即RNA聚合酶，可从头合成引物。例如：大肠杆菌的引物酶分子量60KD，有染色体基因dnaG编码引物合成长10-60个b.3435362.4.1.3 冈崎片段与半不连续复制 半不连续复制假说 1968年,日本冈崎（Okazaki)利用放射性同位素示踪培养大肠杆菌实验而证实，提出了DNA半不连续复制模型。 37半不连续复制要点：1、复制叉的两条摸板链合成新生

9、链的方式不同，即前导链是连续合成的，后随链是不连续合成的；2、前导链的连续合成总是领先于不连续合成的滞后链；38补充：滞后链复制的回环模型回环模型：DNA双链在复制叉初同时进行复制，在滞后链摸板形成一个环。证据：回环模型解释3940412.4.1.4 复制的终止1、链的终止不需要许多蛋白质的参与。2、当子链延伸达到terminus region（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。 Ter-Tus复合物能阻挡复制

10、叉前移，等到相反方向的复制叉到达后，在拓扑异构酶的作用下，使复制叉解体，释放子链。42 复制陷阱43 2.4.1.5 DNA聚合酶 DNA聚合酶的特点和种类 DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能。44 DNA聚合酶的种类DNA聚合酶-校正酶，切除修复酶DNA聚合酶- 酶活性低DNA聚合酶-主要复制酶DNA聚合酶-SOS修复酶DNA聚合酶-SOS修复酶45 表 E.coli 中的三种DNA聚合酶 DNApolDNApol DNA pol 结构分子量 109 KD90 KD90

11、0 KD构成 单体单体异多聚体分子数/细胞 400？10-20酶活性：5 3聚合酶 +35外切酶 +53外切酶 +(可切单链)突变体突变位点pol Apol BpolC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制46 DNA聚合酶I的发现和结构是第一个被鉴定出来的DNA聚合酶。是1956年kornberg(昆伯格）从大肠杆菌中分离出来的。又称为kornberg酶分子量109KD的单链-单体酶。有polA基因编码。47 DNA聚合酶I的结构48DNA聚合酶I的主要位点DNA聚合酶有6个结合位点：(1) 模板结合位点；(2) 引物结合位点；(3)

12、引物3/OH结合位点；(4) 底物dNTP结合位点；(5) 5/3/外切酶结合位点；(6) 35校正位点。 4950 DNA聚合酶的功能 1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 4. 内切酶活性51DNA聚合酶与Klenow大片段来源： 是DNA聚合酶（ Klenow酶）经枯草杆菌蛋白酶水解成2个片段，大片段为7600，小片段为3400。将大片段为7600称谓Klenow大片段功能：具有53聚合功能和35外切活性5253 DNA聚合酶的结构全酶由多个亚基（10种22个）组成，即222 2 2 2 / 2 2 2 其中组成核心酶，其余为辅助蛋白。54 DNA聚合酶的亚基组成5

13、52.4.2 真核生物DNA复制的特点特点：1、有多个复制起始点；2、各个起始点上只能复制起始一次；3、复制的起始需要原点识别复合（ORC）；4、复制叉移动速度慢；5、有15种以上DNA聚合酶。56 真核生物DNA的复制真核生物DNA的复制与原核生物的区别：1、多个复制起始位点；2、不同的复制单元不同时启动；3、复制受调控；57真核生物DNA聚合酶哺乳动物有5种（、）主要酶是DNA聚合酶和5859 真核生物端粒DNA 复制1、端粒是染色体末端的一种特殊结构，是染色体头部和尾部重复的DNA 。2、端粒的存在是为了维持染色体的稳定，没有端粒,则末端暴露,易被外切酶水解，据报道说端粒与生命长短有关。

14、3、端粒DNA是用端粒酶来合成的，端粒酶中含有RNA模板，用来合成端粒. 60端粒DNA的序列结构1、端粒DNA的3端是由数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列。例如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。2、端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。61端粒酶(telomerase)由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性。例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中

15、有一段序列为5-CAACCCCAA-3可作为合成端粒DNA3端GT 丰富序列-GGGGTT-模板。人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板。 62端粒酶复制是1985年发现的一种核糖核蛋白酶，由三部分组成：端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶。该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能，通过一种称为爬行模型的机制维持染色体的完整。端粒酶结合后，依其RNA模板，在端粒单链3-OH为引物基础上，不断反向转录，催化其延长，到一定长度，形成G-G配对的发夹结构，3-OH端回折与互补链方向一致，端粒酶脱落，由DNA聚合酶催化，按新延伸的链为模板合成

16、互补链。DNA末端复制变短和用端粒酶增加其长度，这两个过程处于平衡状态，所以染色体保持大致相同的长度。63小结 端粒酶与端粒复制特点作用：延长端粒 过程：与之互补，反转录，再互补，再转录。一次一个重复序列。分布：生殖细胞和癌细胞 （体细胞无，所以，体细胞继代培养若干代后即停止分裂甚至凋亡。）端粒功能稳定末端结构，辅助末端复制。64 补充：真核生物DNA 复制的代表 病毒SV40 DNA复制病毒SV40 DNA有5243bp.寄生在猴细胞内，形成具有核小体结构的微染色体复制特点： 1、有自身编码的T抗原参与复制，其余组分来自寄主细胞。 2、 T抗原有类似于oriC复制体系中的DnaA的作用65

17、SV40DNA的复制起始区域66SV40DNA的复制起始区序列67SV40DNA的复制过程1、T抗原和RF-A蛋白识别复制起始区， DNA聚合酶、引物酶结合到起始区上，开始合成异端RNA引物；2、RF-C蛋白结合到引物上，促使DNA聚合酶合成前导链的一条片段；随后DNA聚合酶从前导链上解离下来，参与后滞链的合成； DNA聚合酶与RF-C作用结合到前导链的第一段3/-OH末端，继续合成前导链。68小结 细菌和真核复制酶比较 组成 细菌 真核复制酶 聚合酶 聚合酶进行性因子 夹子 PCNA定位因子 复合物 RF-C引物合成酶 引物酶 聚合酶去除引物 聚合酶 RNaseH1/MF-1滞后链修复 聚合

18、酶连接酶 聚合酶连接酶解螺旋酶 DnaB T抗原消除张力 拓扑异构酶 拓扑异构酶单链结合 SSB RP-A692.4.3 DNA复制的调控2.4.3.1 大肠杆菌染色体DNA的复制调控1、染色体复制与细胞分裂是同步的，但不偶连。2、复制的起始与复制子的起始物位点和调节蛋白质的相互作用有关。起始物位点的突变可使复制停止导致细胞死亡。70大肠杆菌染色体复制的调控机制1、在复制子上。2、复制子的调控由复制起始因子和起始位点两部分组成。3、大肠杆菌DNA复制的起始点序列oriC与起始因子dnaA、 dnaH等的相互作用，启动复制。712.4.3.2 质粒ColE1 DNA复制的调控1、质粒ColE1D

19、NA复制从RNA的转录开始。2、RNA转录的起始于ori上游555bp处。3、转录合成的RNA引物有两种调控： （1）RNA（与RNA引物互补的108b的RNA分子） -阻止RNaseH产生RNA引物的3/-OH末端； （2）附近基因编码的蛋白质Rop蛋白抑制引物的形成。72 RNA的调控73 2.4.3.3 真核生物DNA复制的调控有三个水平的调控：1、细胞生活周期水平的调控 细胞周期分为：间期 G1、S、G2 分裂期 M2、染色体复制水平的调控3、复制子水平的调控74 细胞周期75细胞周期的调控发现了细胞周期的控制机制。CDK细胞周期蛋白依赖酶 cyclin细胞周期蛋白质CDK分子可以比作

20、引擎，细胞周期蛋白可以比作齿轮箱以控制引 擎处于空转状态或者驱动细胞继续细胞周期。细胞周期蛋白依赖激酶分子和细胞周期蛋白驱动细胞从一个阶段到下一个阶段。 他们识别出了所有真核生物中调节细胞周期的关键分子，真核生物包括酵母菌，植物，动物和人。这些发现可为人类找到诊疗癌症的新方法。762.5 DNA的修复DNA复制时，会出现碱基错配现象，或因环境因素使DNA损伤等。在细胞内有DNA修复系统。可保证DNA损伤的修复。修复系统有：1、错配修复2、碱基切除修复3、核苷酸切除修复4、直接修复771 错配修复（mismatch Repair）错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子链中的

21、错配几乎完全都被修正，充分反映了母链的重要性。7879802. 碱基切除修复（Base-Excision Repair） DNA gylcosylases能特异性识别常见的DNA损伤（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为AP位点（apurinic or apyrimidinic）。细胞中最常见的Uracil Glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。813. 核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair） 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，由核苷酸切除修复系统负责进行修复。82834.D

22、NA的直接修复（Direct repair） 848586错配修复87找错配碱基88错配修复过程892.6 DNA的转座或移位90 转座因子或转位因子概念发现：1、20世纪40年代由美国的女遗传学家meclintock在玉米中发现的。2、60年代又在酵母和细菌中发现。概念：指基因组中可移动的控制因子。 用Tn表示。 最初叫插入序列（Inserted seguence) 又称IS因子。912.6.1 转位因子结构特点和类型结构特点：1、两端有末端重复序列（TIR）；2、绝大多数转位因子含有开放阅读框（ORF），可能是转座酶的基因，其功能是促进转位因子的转位。3、靶序列在转位因子的两侧形成正向重复

23、序列。9293转位因子的类型原核生物细菌的转位因子根据结构的大小分：1、插入序列，一般小于2000bp2、复合转位子3、 TnA型转位子94 1、细菌的插入序列 细菌的插入序列是细菌染色体和质粒的正常组分。组成：由一段DNA序列和两端重复序列组成。特点： 1、只含有与转位有关的基因，不含有其他基因。 2、末端序列长度一般在1525bp之间。9596 2、复合转位子复合转位子是一类复杂的转位子。组成：有两个重复序列夹着一个或多个结构基因组成。特点：1、除含有转位有关的功能基因外，还含有其它的基因如抗药性基因、抗金属离子基因、抗毒素基因。2、结构较复杂，有200020000bp9798复合转位子基因特征993、 TnA型转位子组成：含有约5000bp的转位子有关基因和抗药性基因。特点：两端没有IS序列，通常含有末端反向重复序列。例如Tn31001012.6.2 转座作用的机理1、转座时插入的靶序列（受体分子的短序列）的DNA会被复制，使插入的转座子位于重复的靶序列之间。2、靶序列复制的机制可能