蛋白质的定量测定一-双缩脲法

1、 1蛋白质含量测定 引言：蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。2 目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法。化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：免疫比浊法。3蛋白质的定量测定双缩脲法实验目的要求 1、学习分光光度法原理，了解分光光度计的结构。 2、掌握双缩脲法测定蛋白质

2、含量的原理及方法。 3、了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用。4分光光度法原理 分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。 5 Lambert定律 一束平行单色光垂直照射于一均匀物质（溶液）时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。 设：入射光强度为I0 L表示溶液的厚度（即光程） 出射光（透过光）强度为I根据辐射能理论推导， I0与I之间关系为 lg（ I0 /I） = K1L （1） K1是常数，受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。6 Beer定律 当一束单

3、色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比 lg（ I0 /I） = K2C （2） K2为吸收系数，是常数，溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比。 7 Lambert-Beer定律（又称吸收定律） 上二式合并（即（l）与（2）合并） lg（ I0 /I） = CL 令A= lg（ I0 /I） ， T= I / I0 ；则 A=CL， A=-lgT 。 T为透光率，A为吸光度（光密度、消光度）。 其中为常数，又称消光系数（extinction coefficient），表示物质对

4、光线吸收的能力，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。8分光光度计的结构 光源：钨灯和氢灯（或氘灯） 单色器 ：分解为单一波长光的装置 狭缝：调节入射单色光的强度，形成平行光 线 吸收池：又称比色杯、比色皿、比色池，装待测溶液用 检测系统：感受光能，转化为电能，输出A值、T值。9本室几类分光光度计22PC型可见光分光光度计 UNICO2000型 10S54型紫外分光光度计 UV8500型紫外分光光度计 11比色杯（比色皿）玻璃比色杯 石英比色杯 荧光比色杯12比色杯使用注意事项 1 、拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面。2 、不得将光

5、学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用檫镜纸擦拭。3、 比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。4、 不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；5、 在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。 13微量移液器吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一停点位置。手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为2-4mm，停留2-3秒后缓慢放松按钮，即回到原来位置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。将取液器吸嘴置于排液容

6、器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁，按压推动按钮至第二停点位置，使溶液排尽，松开按钮。移液完毕，按压卸嘴按钮，将吸嘴脱卸。14【实验原理】具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 15紫红色铜双缩脲复合物分子结构为： 16 但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2NOC-NH -CONH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。 17【实验材料】 1试剂 （1）双缩脲试剂：取1.50g硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC

7、4H4O64H2O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL 10氢氧化钠溶液，1.0g KI；用水稀释到1000mL，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中），避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现，则需重新配制。 182标准和待测蛋白质溶液：（1） 标准蛋白溶液 ：10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。19（2）待测蛋白质溶液 ：测定血清等样品时需做适当稀释，使其浓度在标准曲线测试范围内。3器材 试管、试管架、刻度吸管、微量

8、移液器、旋涡混合器、22PC型、UNICO2000型可见分光光度计、S54型、UV-8500型紫外分光光度计。20【实验方法】1制作标准曲线 取6支干燥洁净试管编号，按下表加入下列试剂：加入物（ml） 012345标准蛋白液/ml 00.20.40.60.81.0蛋白浓度/(mg/ml) 02.04.06.08.010.0蒸馏水/ml 1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂/ml 4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（2025）放置30min A540 21采用标准曲线法，即A540(540nm吸光度值)为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2样品测定 取2支试管，加入待测样品液各1ml，加入双缩脲试剂4ml，室温下（2025）放置30min，用分光光度计测定吸光度。3.结果由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。以mg/ml计。22【注意事项】1本实验方法测定范围110mg/ml