分子生物学基因治疗

1、关于分子生物学基因治疗第一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月一、基因治疗的概念1990人类第一例基因治疗获得成功1966年， Lederberg提出基因治疗概念基因治疗(gene therapy)：将正常基因植入靶细胞代替遗传缺陷的基因,或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病的一种临床治疗技术。人类疾病治疗的重大突破!与传统的方法相比较，从根本上消除遗传病因。第二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月二、基因治疗类型和途径生殖细胞基因治疗(germinal gene thrapy)体外（ex vivo） 间接基因治疗 体细胞基因治疗 ( somatic gene thra

2、py)1、类型2、途径 体内（in vivo） 直接基因治疗第三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月1、基因矫正：原位修复缺陷基因原位替换（同源重组）2、基因添加：正常基因非特异插入基因组以补偿 异常基因的功能缺陷3、基因失活：抑制、关闭异常表达的基 因矫正突变三、基因治疗的策略4、重新开放已关闭的基因第四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月四、基因治疗的方法（一）体细胞的基因治疗方法 2、受体细胞的选择 3 、将治疗转移到受体细胞内 4、将带有目的基因的细胞重新输回体内体外基因治疗时（二）反义技术（antisense technology)（三）RNA干扰（short inter

3、ference RNA)1、治疗基因的制备第五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月五、基因治疗的现状1、一些单基因病的治疗 严重复合免疫缺陷症（ADA综合症）、血友病B、囊性纤维化（CF），苯丙酮尿症等2、 Bata-地中海贫血病 别醇嘌呤重新开放r基因3、多基因病心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等4、肿瘤5、其它疾病：HIV第六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月六、基因治疗的问题、前景问题： 1、 稳定性 2、安全性 3、导入基因的高效表达 4、免疫性 5、伦理问题 前景：十分有潜力的技术，有深远的意义 “基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和肿瘤的治疗，在可见的将来

4、，它将是临床上多种疾病可选择的治疗方法。” 第七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月应用腺苷脱 氨酶基因ADA，经逆转录病毒载体导入严重复合免疫缺陷症（SCID）第八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月遗传病的常规治疗（一）外科治疗 矫正畸形、组织和器官移植 （二）内科治疗 用药物及饮食治疗 1、禁其所忌 酶缺乏不能对底物进行正常代谢 的遗传病。 2、去其所余 酶缺乏使体内贮存过多的“毒物” 所致的遗传病 促排泄剂或螯合剂 、换血或血浆过滤等 3、补其不足 由于基因缺陷使体内缺乏某种酶和蛋白质而导致功能丧失的遗传病。第九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第十张，PPT共四十

5、五页，创作于2022年6月第十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAAACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGAACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA突变基因原位修复突变修复第十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月带异常基因的染色体DNA分子带正常基因的外源同源片段同源重组过程第十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月添加正常基因第十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月使重新表达，形成HbF,HbF代偿HbA的功能。第十五张，PPT共四十五页，创作

6、于2022年6月目的基因的制备方法1、从基因组中分离2、化学合成3、用mRNA逆转录合成cDNA4、从基因文库中筛选5、PCR合成第十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月受体细胞的选择 选择受体细胞的原则： 1、易于从人体分离又便于输回体内 2、易于接受外源的遗传物质 3、能够分裂，生命周期长 4、患病的器官或部位。 常用的受体细胞：骨髓干细胞 皮肤纤纬细胞 血管内皮细胞 肝细胞 淋巴细胞第十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月治疗基因的转移方法3、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)4、单疱疹病毒(Herpes simplex viruses ,

7、HSV)化学法 磷酸钙共沉淀物理法 微粒轰击、电穿孔法 、显微注射 脂质体法生物法 将病毒（virus)改造成缺陷病毒载体1、逆转录病毒载体（ Retroviruses)2、腺病毒介导的基因转移（ Adenoviruses ）第十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月脂质体法优点：易大量制备无致病性细胞类型多治疗过程可控缺点：转化效率不高血循中快速清除(肝巨噬细胞)第十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第二十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月逆转录病毒的改造第二十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月逆转录病毒感染细胞过程第二十二张，PPT共四十五页，创作于202

8、2年6月逆转录介导基因转移的优缺点优点：1、能高效率的感染宿主细胞（100%）2、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型3、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达4、用复制缺陷的重组逆转录病毒感染，毒性小缺点：1、只能感染分裂细胞2、其外源DNA的容量太小3、安全性问题（激活癌基因的潜在性）第二十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月腺病毒感染细胞的过程第二十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月腺病毒介导基因转移的优缺点优点：1、具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎所有细胞2、可以感染分裂及非分裂细胞3、能高效地感染宿主细胞4、外源基因容量大5、安全性较高（不引起癌

9、基因激活）缺点：1、技术上需进一步改进 2、不整合到人类基因组 腺病毒是基因治疗载体的发展方向。第二十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月1、野生型的AAV为非病原性，其安全性高2、AAV病毒颗粒的物理化学性质较为稳定3、应用宿主范围较广，使用于分裂及非分裂细胞4、可整合入宿主染色体上，可长期表达目的蛋白腺相关病毒载体优点：缺点：重组AAV的制作较为繁杂、效率低，滴度 低第二十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月单疱疹病毒载体优点 具有对神经元的特异的亲和力 可插入的基因片段容量很大，可达40-50kb缺点 对细胞有较大的毒性第二十七张，PPT共四十五页，创作于2022年6月反

10、义技术 反义技术（antisense technology)也称反义寡核苷酸,是指利用人工合成的反义RNA或反义DNA来阻断基因的转录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以达到治疗某中疾病的目的。(1)将cDNA导入基因组中，转录得反义RNA(2)直接输入反义寡核苷酸二、反义基因技术（阻断转录）类型：1、反义RNA技术（阻断翻译）第二十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月 第二十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月 第三十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月转录阻断反基因技术示意图第三十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月第三

11、十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月正常细胞(无细胞毒性)胞嘧啶脱氨酶基因erbB-2启动子5-FC5-FC5-FU(细胞毒性)肿瘤细胞肿瘤特异性高表达因子药物靶向治疗肿瘤细胞死亡第三十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月RNA干扰（ RNA interference RNAi ) 2003年10大科学进展-第四 (Science)正常生物体内一些小的双链RNA可以抑制特定基因表达的一种现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的小双链RNA (double stranded RNA，dsRNA)时，可以通过促使该mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而导致基

12、因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。这些小的双链RNA称为siRNA (Small/short interfering RNA，siRNA)。第三十四张，PPT共四十五页，创作于2022年6月RISC: RNA-induced silencing complex RNA诱导沉默复合物第三十五张，PPT共四十五页，创作于2022年6月RNAi in gene therapy第三十六张，PPT共四十五页，创作于2022年6月基因治疗的现状-1第三十七张，PPT共四十五页，创作于2022

13、年6月基因治疗的现状-2第三十八张，PPT共四十五页，创作于2022年6月基因治疗的现状-3第三十九张，PPT共四十五页，创作于2022年6月基因治疗的现状-4第四十张，PPT共四十五页，创作于2022年6月基因治疗的现状-5第四十一张，PPT共四十五页，创作于2022年6月基因治疗的现状-6第四十二张，PPT共四十五页，创作于2022年6月Hemophilia B,FIX function reduced, X-linkedMales to bleed after circumcision第一例临床实验中国上海1995-1996年载体AAV自体皮肤成纤维细胞两名血友病B患者(兄弟), 先后治疗了四名患者FIX水平升高2倍并持续了1年以上 2003年获得国家批准进行中国首次AAV基因治疗血友病B临床试验中国的基因治疗第四十三张，PPT共四十五页，创作于2022年6月AAV based gene therapy for hemophilia B1. Viral genes are removed from AAV 2. A gene for blood clotting protein Factor IX is placed inside the empty AAV 3. The Factor IX-bearing viruses are injected int