实时荧光定量PCR介绍课件

1、实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司20 August 2022主 要 内 容Real Time PCR基础知识12Real Time PCR实验方法3Real Time PCR解析方法4Real Time PCR应用实例Real Time PCR基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCR基础知识1Real Time PCR的用途Real Time PCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测差异显示结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析病毒及病原菌

2、检测物种鉴定基因分型绝对定量相对定量Real Time PCR的原理 激发光发射光使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。Real Time PCRCt值Real Time PCR基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCR基础知识1TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBR Green I荧光染料嵌合法荧光探针法Real Time PCR的检测方法荧光染料嵌合法（SYBR Green I）SYBR Green I：是一种能结合于所

3、有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。SYBR Green IPrimer退 火 FFFFSYBR Green I 法作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延 伸 FFFFFFPrimer热变性 FFFFTaqMan法作用机理TaqMan探针为一寡核苷酸，5 端标记一个报告基团（Reporter），3 端标记一个淬灭基团（Quencher）。 RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性 退 火 延 伸 TaqMan Probe法原理示意图 One-Step RT-PCR特异性高多重PCR检出Probe设计要求高 Probe法 Probe合成

4、费用高SYBR Green I 法与Probe法比较常用于mRNA表达量分析等SYBR Green I 法 简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌检测主 要 内 容2Real Time PCR实验方法反转录反应Real Time PCR反应RT Primer的选择 Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific PrimerOligo dT PrimerPCR R-PrimerPCR F-Primer目的片段在距Poly(A) Tail

5、1.5 kbp 以内适用，RT效率较高。One Step RT-PCR 只能使用Gene Specific Primer，但不适用于复数基因的检出。53Gene Specific Primer目的片段RFAAA53目的片段RF1,500 baseOligo dT PrimerRandom目的片段53RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。Oligo dT Primer53RFAAA目的片段Random适用于mRNA表达量分析，提升反应检测的灵敏度。RT Primer的选择Real Time PCR引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的

6、是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同= 对引物设计要求严格普通PCR引物Real Time PCR引物两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值 Tm值40-60%(最好45-55%) GC含量Primer长度80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)扩增片段大小17-25 base使用BLAST检索，确认引物特异性 特异性 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 引物3 末端避免2 base以上的互补序列 互补性3 末端序列 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GC rich或A

7、T rich(特别是3 端) 避免T/C连续，A/G连续序列 3 末端避免GC rich或AT rich 3 末端碱基最好为G 或C 3 末端碱基尽量避免为T尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增 RT-PCR用引物Real Time PCR引物设计原则探针的Tm比引物高8-10 Tm值20-24 bp Probe长度探针5 末端的第一个碱基不能是G5 末端序列 目的序列GC含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3 端)；避免T/C 连续，A/C连续序列Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以

8、上的互补序列 互补性BLAST检索确认Probe特异性 特异性Real Time PCR用TaqMan探针设计原则Real Time PCR探针设计原则线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认PCR扩增效率（E）：0.8-1.235Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。No Template Control确认30Cycles内无引物二聚体产生。相关系数（r2）：大于0.98反应性能确认主 要 内 容3Real Time PCR解析方法1. 标准曲线分析2. 融解曲线分析3. 绝对定量和相对定量解析方法标准曲线制作扩增曲线标准曲线标准品梯

9、度的选择：56个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10105 104 103 102 101 100 105 104 103 102 101 100标准品的种类 基因组DNA 质粒 Total RNA & cDNA 体外转录RNADNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品质粒标准品构建流程基因组DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因质粒质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。体外转录RNA标准品构建流程RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。T7 RNA polymerase

10、体外转录RNATotal RNAPCRcDNARTT7 PromoterTTTTTPCR产物目的基因目的基因目的基因AAAAAAAAAA理想的标准品扩增曲线基线平整Negative Control为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。 扩增效率 相关系数 扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1 Real Time

11、 PCR解析方法3Real Time PCR解析方法1. 标准曲线分析2. 融解曲线分析3. 绝对定量和相对定量解析方法融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 SYBR Green I 法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。特异性产物非特异产物引物二聚体对PCR产物特异性进行分析融解曲线分析3Real Time PCR解析方法1. 标准曲线分析2. 融解曲线分析3. 绝对定量和相对定量解析方法Real Time PCR解析方法绝对定量解析方法提取样品引物设计标准品制备Real Time PCR反应数据分析流程绝对定量解析方法通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷

12、贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。105104103101扩增曲线图标准曲线图 检测样品检测样品102相对定量解析方法以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。Sample BSample A目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同进行相对表达量分析必要性实际上目的基因表达量分析相对定量解析方法管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、-actin等。筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选主 要 内 容Real Time PCR基础知识12Real Time PCR实验方法3R

13、eal Time PCR解析方法4Real Time PCR应用实例 对SARS病毒基因进行定量分析绝对定量相对定量 分析小鼠PAH基因在不同组织中的表达量变化绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量 检测方法 TaqMan probe 法 检测样品 3个从SARS样品中提取的Total RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（DRR064） 仪 器 Smar

14、t Cycler SYN247 F02SYN247R03SYN247 F01SYN247R02SYN247R01SYN247 F01BamH Hind pBluescript II SK(+) VectorT7 PromoterBamH Hind Sac site SARS Control RNA构建绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 纯化的SARS Control RNA OD值测定结果 体外转录的SARS Control RNA 电泳照片M1 M2M1: -Hind digest M2: DL2,000 MarkerDNase I处理前DNase I处理后绝对

15、定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量DNA BNITMSARAs2 Adaptor R Sacsite Bam Hsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 PromoterSARS Internal Control RNA的构建AApBluescriptII SK(+) Vector 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量探针的选择 TemplatePrimerTaqMan Probe5 端报告基团3 端淬灭基团SARS Control RNAor SARS Genomic RNA共用FAM标记Eclipse标记SARS Inter

16、nal Control RNA共用ROX标记Eclipse标记绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量SARS Control RNA 105-101扩增曲线 SARS Genomic RNA Sample 1、扩增曲线 SARS Internal Control RNA扩增曲线 标准曲线 绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量定量结果对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况检测方法 SYBR Green I 荧光嵌合法

17、管家基因 GAPDH基因目的基因 PAH基因标 准 品 cDNA试 剂 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （DRR047） SYBR Premix Ex TaqTM II (Tli RNase H Plus) （DRR820）仪 器 Thermal Cycler Dice Real Time System （TP800） Total RNA提取Total RNA基因组DNA去除标准品RNA制备标准曲线制作及预实验详细的实验资料获取实验设计及引物 设计、合成样品Real Time PCR反应相对定量计算及数据分析数据整理及论文撰写相对定量应用

18、例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况提取Total RNA后电泳照片提取试剂：TaKaRa RNAiso Plus （ D9108 ）相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况M C L B M M：DL2,000 DNA MarkerC：Control RNAL：Liver RNAB：Brain RNA目的基因标准曲线制作结果扩增曲线图融解曲线图标准曲线图管家基因标准曲线制作结果相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况扩增曲线图样品目的基因定量结果样品管家基因定量结果管家基因 GAPDH目的基因 PAH定量结果平均值定量结果平均值通过GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝脏和脑中PAH的相对表达量样品a12288002221751966002011750.905 3757 212700204400样品a2227300207100219900196600样品 b133360034097576.80 82.182.4110-4134030092.65 样品 b235410082.46 33590076.80 相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况 通过双标准曲线方法计算得出，苯丙氨酸