铜绿假单胞菌方法学验证报告

1、青岛海尔电器上海博迅实业成都世纪方舟科技有限公司江苏金坛环宇科学仪器厂北京五洲东方科技发展有限公司 上海浦春计量仪器有限公司 北京中兴伟业仪器有限公司 上海安亭电子仪器厂北京陆桥技术股份有限公司 北京陆桥技术股份有限公司GB 85382016铜绿假单胞菌方法学验证报告一、验证目的验证食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验法 GB 8538-2016-铜绿假单 胞菌检验在本实验室的适用性。二、验证方法样品采样方案依据GB4789.1-2016食品微生物学检验 总则的要求进行, 本实验样品取三个不同品牌的饮用天然矿泉水的典型样品进行实验，严格按照 GB8538-2016 进行。表1:实验方法设计表样

2、品种类样品名称样品编号实验人员实验方法包装饮用水xxxxxxa、b双人双平行包装饮用水xxxxxxa、b双人双平行包装饮用水xxxxxxa、b双人双平行除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104）接种培养而成，与样品 实验程序同时进行。三、验证设备和试剂.冰箱：SC-322.生化培养箱：SPX-150B-Z.电位pH计：PHS-3C+ （精确度0.01）.恒温振荡器：SHA-A.菌落计数仪：Scan-500.天平：JE-502.六联不锈钢过滤器.三用紫外分析仪：ZF-2培养基和试剂：.假单胞菌琼脂基础培养基.

3、绿脓菌素测定用培养基.金氏B培养基北京陆桥技术股份有限公司.营养琼脂北京陆桥技术股份有限公司.氧化酶试剂北京陆桥技术股份有限公司.乙酰胺肉汤北京陆桥技术股份有限公司.三氯甲烷国药集团有限公司.纳氏试剂北京陆桥技术股份有限公司四、验证环境.依据消毒与灭菌效果的评价方法与标准 GB15981-1995定期对高压蒸汽灭菌 锅的灭菌效果进行检测评价并记录；.依据无菌室消毒灭菌操作规程定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒 灭菌并记录；.依据实验室质量控制规范食品微生物检测 GB/T27405-2008定期对对无菌室 及生物安全柜进行沉降菌检测并记录；.无菌室检验：详见XXXX ;五、验证步骤1.操作步

4、骤. 1水样过滤在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌银子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将 250mL水样或稀释液通 过孔径0.45 m m的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的 CN琼脂平板 上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。培养将平板倒置于36c 1C培养24h48h,并防止干燥。结果观察在培养20h24hffi40h48h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数。计数所有显蓝色 或绿色（绿脓色素）疑似铜绿假单胞菌的菌落，并进行绿脓菌素确证性试验。在紫 外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落 杀灭，而导

5、致无法在证实培养基上生长。计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑 似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确证性试验。将其他所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、乙酰胺液体培养基、金氏B 培养基确证性试验，培养20h24h观察结果,防止因为培养40h48h导致菌落过 分生长而出现菌落融合。最终的铜绿假单胞菌菌落计数应按3中式（1）进行计算。在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤见表 2。表2:在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤CN琼脂上生长的菌落形态乙酰胺肉汤氧化酶 试验在金氏B培养基上产生荧光判定为铜绿 假单胞菌蓝色/绿色NT aNTNT是产荧光（非蓝/绿）+NTNT是红褐色+是其他颜色NTNTN

6、T否a备注：NT表示不用测试。确证性试验营养琼脂尽可能将所有经滤膜过滤后，在 36c 1C培养了 20h24h,将需验证的可疑菌 落划线接种营养琼脂培养基，于36C 1C培养20h24h。检查再次纯化的菌落, 并将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验。氧化酶试验取2滴3商新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上，用铝金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上，在10s内显深蓝紫色的视为阳性反应。金氏B （ King sB ）培养基将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于36c 1 C包温箱培养24h5do每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5

7、d内产生荧光的菌落记录为阳性。绿脓菌素试验取可疑菌落2个3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置 36 C 土 1 C培养24h 2h,加入三氯甲烷3mL5mL,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲 烷液内，待三氯甲烷提取液呈蓝色时，用吸管将三氯甲烷移到另一试管中并加入 1mol / L的盐酸1mL左右，振荡后静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫 红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。乙酰胺液体培养基将纯培养物接种到装有乙酰胺液体培养基的试管中，在36 C 土 1 C下培养20h24h。然后向每支试管培养物加入1滴2滴钠氏试齐检查各试管的产氨情况， 如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化

8、，则为阳性结果，否则为阴性。.计数将产生绿脓色(蓝色/绿色)或氧化酶反应呈阳性、在紫外灯下产生荧光，且在 乙酰胺肉汤中产氨的所有菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。通过计数培养后的滤膜上的菌落以获得铜绿假单胞菌的数量 ，其他呈红褐色的菌落需要进一步 验证。.结果与报告滤膜上的特征菌落可证实为铜绿假单胞菌的菌落。计算菌落数时应考虑到验 证试验的比例及特定的水量，过滤的水样的体积应为 250mL。菌落计数按式(1) 计算：N = P + F ( c F / n F ) + R ( c R / n R ) ( 1 ) 式中：P一呈蓝/绿色的菌落数；F一显荧光的菌落数；c F一产氨阳性的显荧光菌落数;

9、n F一进行产氨测试的显荧光菌落数；R一呈红褐色的菌落数；cR一产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数； n R 一进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。根据蓝色或绿色菌落的计数和确证性试验的结果，计算每 250mL水样中的铜绿 假单胞菌数量，结果以CFU/250mL计。六、验证结果实验结果如表3所示，详细实验结果见铜绿假单胞菌检验原始记录表。表3:铜绿假单胞菌检验实验结果统计表组别样品名称 和编P实验员实验结果平行误差两组误差一组AXXXXan=5,c=0,m=0,未检出无差异无差异an=5,c=0,m=0,未检出二组bn=5,c=0,m=0,未检出无差异bn=5,c=0,m=0,未检出一组BXXXXan=5,c=0,m=0,未检出无差异无差异an=5,c=0,m=0,未检出二组bn=5,c=0,m=0,未检出无差异bn=5,c=0,m=0,未检出一组CXXXXan=5,c=0,m=0,未检出无差异无差异an=5,c=0,m=0,未检出二组bn=5,c=0,m=0,未检出无差异bn=5,c=0,m=0,未检出经过该方法的双人双平行论证，从表3可看出，包装饮用水-A、包装饮用水-B、包装饮用水-C的平行误差和两组人员误差