发酵生产二羟丙酮工艺研究

1、 发酵生产二羟丙酮工艺研究 摘 要1,3-二羟丙酮（DHA）是一种重要的医药化工中间体，在精细化工、食品工业、化妆工业和水质净化等方面有着广泛的应用前景。目前DHA已经被广泛的应用于保湿防晒化装品中；在低血糖与与糖尿病的治疗上，限量口服DHA与葡萄糖相比，DHA能更大幅度的提高呼吸频率，增大氧气消耗，有效地防止过量-羟基丁酸及乙酰乙酸的形成。此外1,3-二羟基丙酮衍生物是一类非常重要的中间体：可用于羟醛缩合反应制取各种手性化合物；经生物或化学法还原可得到具有光学活性的仲醇；直接用于光学反应中的Diels Alder加成反应制备糖类化合物或经进一步的反应用于该类加成反应；与卡宾发生插入反应；与2

2、,2-二烷氧基丙烷衍生物作用制备内酯；用于制备一些桥环化合物进而开环得到众多有用的环状化合物。DHA通过甘油转化获得，制备方法已从过去的化学合成法转向微生物发酵法。在国外，微生物发酵生产DHA已得到了大规模的工业应用，国内近年来有微生物转化甘油生产DHA的报道，与国外相比，菌株产率较低，无法达到工业生产的要求。关键词：二羟丙酮；微生物发酵法；影响因素正 文一、引言 二经基丙酮或1,3 一二经基丙酮，英文名为1,3-dihydroxyacetone 或dihydroxyacetone，简写为DHA,是最简单的三碳酮糖，外观是白色或类白色粉末状结晶， 具有甜、凉的味道， 易吸湿并分解。一般状态下是

3、二聚体(1,4-Dioxane)的结晶，能缓慢地溶于1 份水中或15 份乙醇中，微溶于乙醚，但经溶解或加热则变为单体，其单体易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂，熔点为7580，水溶性250 g/L-1(20)，在pH 为6.0 时稳定，是一种重要的化工、生化原料，医药、农药合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。 DHA 的生产方法主要有化学合成和微生物发酵两种方法:1.1 化学合成法 最常见的二轻基丙酮化学合成方法主要有一溴丙酮酯化醇解法和1,2 一丙二醇的氧气或K2Cr2O7/H2SO4氧化法两种。前者反应条件温和、合成用生产设备要求低且简单、产品收率高、产品纯度高，但主原料一溴丙酮

4、的价格导致生产成本过高是该方法的最大缺点；后者与前者刚好相反，反应条件及设备要求高、需要用昂贵的金属催化剂、产品收率不高，但原料成木低并可连续化或半连续化生产。1.2 微生物发酵法与化学合成法相比，微生物发酵生产DHA 具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、生产工艺相对简单、副产物少，同时微生物发酵制备的DHA 可应用于食品和医药工业领域等优点，成为人们研究的重点。本文所叙述的就是采用发酵工艺生产二羟丙酮以及初始PH对发酵法生产二羟基丙酮的影响。二、实验内容1.5L、10L、70L发酵罐发酵生产二羟基丙酮配料、灭菌、接种操作过程实验2.二羟基丙酮标准曲线制作及发酵液中二羟基丙酮含量的测定3

5、.不同发酵条件(主要为PH)对微生物生产二羟基丙酮影响的研究三、实验材料及操作3.1 实验材料3.1.1 菌种：氧化葡萄糖酸杆菌GL583.1.2 斜面菌种保存培养基（%）： 甘油5.0，葡萄糖5.0，酵母膏1.0，碳酸钙0.3，琼脂1.8，PH6.03.1.3 发酵种子培养基（%）： 甘油5.0，葡萄糖5.0，酵母膏1.0，碳酸钙0.3，PH6.03.1.4 摇瓶发酵培养基（%）：甘油12.0；酵母膏0.5；碳酸钙0.7，PH自然3.1.5 试剂：显色液（浓硫酸：无水乙酸：二苯胺=6 mL:54 mL:0.6g）3.1.6 仪器：容量瓶，摇床，酸度计，比色皿，离心机，胶头滴管，三角瓶3.2

6、实验操作3.2.1 显色液配置 取浓硫酸、无水乙酸、二苯胺按浓硫酸：无水乙酸：二苯胺=6 mL:54 mL:0.6g的比例配置显色液180ml，配置时将浓硫酸倒入无水乙酸冷却后加入二苯胺。3.2.2 二羟丙酮标准曲线制作（1）DHA 系列标准溶液的配置准确称取二羟丙酮标准品0.05g，用蒸馏水于100mL 容量瓶中定容，作为0.5mg/mL 的母液，按下表稀释二羟丙酮的标准曲线编号12345对照母液量（ml）51015200定容到（ml）2525252525溶液终浓度（mg/ml）0.50.10.20.30.40.0A值（2）DHA 标准曲线的制备：分别取上述标准浓度的DHA 溶液1mL 于比

7、色管中，加入9mL 显色液稀释，沸水浴15min 使其显色（大概5min 后就有颜色变化），取出冷却后，在分光光度计波长615nm 下测定其吸光度值A 值；根据上表以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标，在Excel 中作标准曲线。3.2.3 发酵液中二羟丙酮测定取发酵液5mL8000rpm 离心10 分钟 上清液1.5mL 或2mL 或3mL500mL 定容取1mL9mL 显色液混匀沸水浴15 分钟分光光度计615nm 测吸光度值，根据标准曲线获得函数公式计算出DHA 含量。3.2.4 发酵法生产二羟丙酮工艺研究（1）菌种及培养基如上实验材料所述 摇瓶发酵培养基按甘油12.0；酵母膏0.5；碳酸钙0

8、.7，PH自然配置培养基200ml。（2） 培养发酵工艺条件 种子培养条件：250mL 三角瓶装50mL 种子培养基，121灭菌15min，30摇床培养18h左右。 发酵条件研究：初始pH 对发酵的影响500mL 三角瓶装50mL 培养基，分别调pH4；自然pH 和8；121灭菌15min，分别接种5mL 种子；每分钟转250 转，30摇床培养，72h 取样测定二羟丙酮含量。四、 实验结果与讨论4.1 标准曲线制作所得的标准曲线数据见表4-1表41 标准曲线数据表编号12345对照母液量（ml）51015200定容到（ml）2525252525溶液终浓度（mg/ml）0.50.10.20.30

9、.40.0A值0.9550.2450.4200.6320.7710由表中数据在Excel 中作出如下图形：如图所示，标准曲线方程为：y = 0.5629x - 0.0403R2值： R = 0.9969按照要求所绘制的标准曲线的R2 应该大于0.99，从图中可以看出，我们小组的标准曲线R2=0.99250.98,故符合要求。从图中还可以看出部分点不在直线上而是在直线的两侧。造成实验误差的可能原因：称取二羟丙酮时造成的偶然误差误差；测吸光度时由于读数跳动平率高，读数不准确所造成的偶然误差；显色液显色时放置时间太长；仪器所造成的系统误差4.2 初始PH对发酵的影响4.2.1 实验数据500mL 三

10、角瓶装50mL 培养基，分别调pH4；自然pH 和8；121灭菌15min，分别接种5mL 种子；每分钟转250 转，30摇床培养，72h 取样测定吸光度并根据标准曲线计算出二羟丙酮含量。实验数据及计算结果如下表：表4-2 PH对生产DHA的影响曲线PH4.自然（6.4）8吸光度A0.7310.7500.683DHA含量mg/ml0.3710.3820.344由表中数据在Excel 中作出如下图形：由图中可以看出：PH在一定范围内对DHA 产量其促进作用，随着PH升高才对发酵起到促进作用；超过一定值时，随着PH值升高不但不会有促进作用，反而会对DHA产量起到抑制的作用，即随着PH升高产量减小。

11、参考文献1 孙丽慧，胡忠策，郑裕国，沈寅初 微生物法生产1,3-二羟基丙酮代谢工程研究进展浙江工业大学生物工程研究所，杭州 3100322 李尧 微生物发酵生产二羟基丙酮的应用研究进展 西南石油大学, 成都6105003 许晓菁, 陈询, 晋明芬, 武晓炜, 王祥河 微生物法生产二羟基丙酮的研究进展 1. 天津大学化工学院, 天津 300072 2.天津工业微生物研究所, 天津 3004624 杜冰，刘长海，姚如华 微生物发酵生产DHA的研究 1.仲恺农业技术学院食品系，广东 广州 510225 2.华南理工大学食品与生物工程学院，广东 广州 5106405 叶磊，张维广，曹丽群，陈盼 微生物

12、发酵生产DHA 西南大学食品科学学院，重庆 40076 熊宗贵 主编 发酵工艺原理 中医药科技出版社 2005年6月心得体会 DHA 的生产方法主要有化学合成和微生物发酵两种方法,即化学合成法和微生物发酵法。最常见的二羟基丙酮化学合成方法主要有一溴丙酮酯化醇解法和1,2- 丙二醇的氧气或K2Cr2O7/H2SO4 氧化法两种。前者反应条件温和、合成用生产设备要求低且简单、产品收率高、产品纯度高, 但主原料一溴丙酮的价格导致生产成本过高是该方法的最大缺点；后者与前者刚好相反,反应条件及设备要求高、需要用昂贵的金属催化剂、产品收率不高,但原料成本低并可连续化或半连续化生产。与化学合成法相比, 微生

13、物发酵生产DHA 具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、生产工艺相对简单、副产物少, 同时微生物发酵制备的DHA 可应用于食品和医药工业领域等优点, 成为人们研究的重点。目前研究发现，很多微生物都能够利用甘油或甲醇为底物代谢产生DHA，利用微生物代谢产生DHA 通常有两种途径。一种产生DHA 路线是以甘油为底物，利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶，将甘油分子结构中2 位C 上的羟基进行脱氢反应，转化成DHA；另一种产生路线是以甲醇为底物，首先将甲醇氧化生成甲醛，然后与5-磷酸木酮糖在二羟基丙酮合成酶的作用下生成DHA 和3-磷酸甘油醛。在所有产DHA的微生物中，有关氧化葡萄糖酸杆菌Glucon

14、obacteroxydans 的研究报道最多，该菌种生产性能稳定，甘油生成DHA 的转化率高，是目前用于工业化生产的主要菌株。氧化葡萄糖酸杆菌是一种专性好氧的G- 菌, 属于醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)。在麦芽汁琼脂和酵母膏葡萄糖琼脂平板上的菌落呈圆形, 乳白到微黄色, 有时中央变褐或周围带黄色。在酵母膏葡萄糖酸琼脂上生长良好, 形成或不形成5- 酮基葡萄糖钙结晶。在含酵母膏、乙醇、CaCO3 琼脂上生长良好,并产生乙酸, 溶解CaCO3, 平板上呈透明圆圈。其生长最适温度2530, 最适pH 5.56.0。氧化葡萄糖酸杆菌含有多种酶类, 有些酶可以催化氧化一系列底物。Asakura等研究发现, G. oxydans中的葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酮酸脱氢酶和醛糖脱氢酶都能够作用于多种化合物, 而且G. oxydans 中几乎所有的葡萄糖脱氢酶活性及一半的葡萄糖酮酸脱氢酶活性来源于L- 山梨糖/L- 山梨酮脱氢酶。同时大多数的此类酶位于细胞膜上, 只有少数在细胞浆中, 在催化底物反应过程中无需底物和产物的透膜运输, 大大提高了其应用价值, 因此, 氧化葡萄糖酸杆菌广泛应用于二羟基丙酮、维生素C、D- 葡糖酸等工业化生产, 具有非常高的工业价值在具体的操作中，显色液的配置需将浓硫酸加入无水乙酸中，待冷却后加入二