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1、 病 毒第一节 病 毒非细胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒类病毒：只含具侵染性的RNA组分卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分朊病毒：只含蛋白质特点： 无细胞结构，专性活细胞内寄生； 没有酶或酶系统极不完全，不能进行代谢活动； 个体极小，能通过细菌滤器； 对抗生素不敏感，对干扰素敏感。病毒是超显微的，没有细胞结构的，专性活细胞内寄生的实体。它们在活细胞外具有一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。一、病毒的形态构造和化学成分（一）病毒的大小个体小，必需在电镜下观察；不同病毒的毒粒大小差别很大；毒粒的形状大致可分球形颗粒(或称拟球形颗粒)、杆状颗粒和复杂形状颗粒

2、（如蝌蚪状，卵形）等少数几类。（二）病毒的形态1、典型病毒粒的构造基本成分核酸位于中心，称为核心蛋白质包围在核心周围，形成衣壳核心和衣壳合称核衣壳，为病毒的基本结构。有些复杂的病毒在衣壳的外面包裹着一层由脂类和多糖组成的包膜。有的包膜上还长有刺突。2、病毒粒的对称体制螺旋对称二十面体对称复合对称无包膜有包膜无包膜有包膜无包膜有包膜3、病毒的群体形态噬菌体感染细菌后，使细菌细胞破裂死亡，连续重复感染使大量的细菌死亡，在培养细菌的平板上，可以看到一个个透明不长细菌的小圆斑，称为噬菌斑。人工培养的单层动物细胞感染病毒后，也会形成类似噬菌斑的动物病毒群体，称为空斑。单层动物细胞受到肿瘤病毒的感染后，会

3、使动物细胞恶性增生，形成类似细菌菌落的病灶，称为病斑。烟草花叶病毒感染烟草后，在叶片上出现的一个个坏死的病灶，称为枯斑。1、螺旋状对称型：烟草花叶病毒（TMV） 呈直杆状，长300nm，宽15nm，中空内径4nm，由158个氨基酸组成一个皮鞋状的衣壳粒，相对分子量为17500，总共2130个衣壳粒，排列成130圈螺旋，核酸核心是单链的RNA，相对分子质量为260万，含有6390个核苷酸，每3个核苷酸与一个衣壳粒相结合，盘绕于蛋白质的中空内径中。（三）3类典型形态的病毒及其代表 二十面体具有12个角、20个面 和30条棱。腺病毒的衣壳是典型的二十面体对称， 由252个衣壳组成，没有包膜。腺病毒的

4、核心是由线状双链DNA构成的。 其基因组的大小都约为36500个核苷酸对。2、二十面体对称型： T4由头部（核心是双链线状DNA）、颈部和尾部（尾鞘、尾管、基板、刺突和尾丝）三个部分构成。3、复合对称型：偶数噬菌体4、 病毒的核酸 核酸是病毒的遗传物质；控制着病毒的增殖及对 宿主的感染性； 一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；病毒核酸单链DNA（ss DNA）；双链DNA（ds DNA）；单链RNA（ss RNA）；双链RNA（ds RNA）；二、四类病毒及其繁殖方式（一）原核生物的病毒噬菌体与其他病毒一样，噬菌体除有其特异性宿主外，并无显著区别。它们都是由蛋白质和核酸组成。基本形

5、态为蝌蚪形、球形、和丝状三种。从结构看以可分为六种不同的类型。1、噬菌体的繁殖病毒粒子并无个体的生长过程，而只有其两种基本成分的合成和装配，即： 核酸复制+蛋白质合成核蛋白（病毒粒子）噬菌体的繁殖一般可分五个阶段，即吸附 侵入增殖（复制与生物合成）成熟（装配）裂解（释放）尾丝尖端与宿主细胞表面的特异性受体接触，可触发尾丝散开，附着在受体上，随之把刺突、基板固定（1）吸附病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。（2）侵入吸附尾钉固着尾鞘收缩尾管穿入DNA注入尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入

6、胞内，蛋白质外壳留在胞外；（3）增殖 病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。（4）成熟（装配）T4噬菌体的装配是一个极为复杂的指导装配的过程（5）裂解（释放）吸附侵入早期：病毒特异性酶的合成病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成装配释放病毒大分子合成2、噬菌体效价的测定效价表示每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数又称噬菌斑形成单位（pfu）或感染中心 测定的方法双层平板法 用双层平板法测出的效价比用电镜直接记数得到的效价低。 前者是计有感染力的噬菌体粒子，后者是计噬菌体的总数。 一步生长曲线可分为三个时期： 潜伏期是指菌体的核酸侵入宿主细胞后至第 一

7、个噬菌 体粒子装配前的一段时间。 裂解期是指溶液中噬菌体粒子急剧增多的一 段时间。 稳定期溶液中噬菌体总数达到最高点后的时期。3、一步生长曲线定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称作一步生长曲线4、溶 源性 温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage）：感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象附着或融合在溶源性细菌染色体上的温和噬菌体的核酸称为原噬菌体或前噬菌体。前噬菌体含有温和噬菌体的DNA 而又找不到形态上可见的噬菌体粒子的宿主细菌叫溶源性细菌。溶源性细菌的基本特性： 自发裂解 诱发裂解

8、 免疫性 复愈性 溶源转变植物病毒没有专门的吸附结构，通过昆虫口器、摩擦伤口和人为伤口进入寄主细胞。植物病毒在入住宿主细胞后脱去蛋白质外壳。 TMV的衣壳粒以双层盘的形式组装成衣壳，PH的改变、RNA的嵌入对衣壳的装配起关键作用。（二）植物病毒（三）人类和脊椎动物病毒脊椎动物病毒包括DNA和RNA病毒，动物病毒的释放方式多种多样，主要有以下几种形式：1.无包膜的病毒，如腺病毒通过细胞裂解或局部破裂而释放。2.有包膜的DNA病毒，如疱疹病毒，以细胞质中通道释放到细胞外。3.有包膜的RNA病毒，如副流感病毒用出芽方式通过寄主细胞膜， 释放到细胞外并获得细胞源性的包膜和产生刺突。腺病毒的复制可代表D

9、NA病毒的复制脊髓灰质炎病毒的复制可代表RNA病毒的复制1.吸附：腺病毒吸附在宿主细 胞表面的糖蛋白受体上。2.穿入：通过吞噬作用进入胞内。3.脱壳：寄主细胞的蛋白酶 水解腺病毒衣壳。 4.在宿主细胞核内转录早期 mRNA并翻译早期蛋白。5.在宿主细胞核内复制出病毒的 DNA和晚期mRNA。 一些带有囊膜的病毒，如单纯疱疹病毒，当它们的核酸和衣壳蛋白组装完毕后，它们将以“出芽”的方式，包裹寄主细胞的细胞膜或核膜，从寄主细胞中释放出来。 引起爱滋病的病毒人类免役缺陷病毒（HIV）从淋巴细胞中释放出来（四）昆虫病毒多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称多角体，成分为碱溶性结晶蛋白

10、，其内包裹着数目不等的病毒粒。核形多角体病毒（NPV）：在昆虫细胞核内增殖、具有 蛋白质包涵体的杆状病毒 质形多角体病毒（CPV）：在昆虫细胞质内增殖、可形 成蛋白质包涵体的球状病毒 颗粒体病毒（GV）：具有蛋白质包涵体，每个包涵体 内通常仅含一个病毒粒的昆虫杆 状病毒主要有三种类型：第二节 亚 病 毒1971年T.O.Diener阐明马铃薯纺锤形块茎病毒的病原是一种具有感染性和自主复制能力的低分子RNA（类病毒，Diener,1971）以后又发现了称之为拟病毒(Randles,1981)的植物病毒Prusiner发现了朊病毒(Prusiner,1982)。一、类病毒类病毒是裸露的，仅含一个单

11、链环状低相对分子质量RNA分子的病原体。 发现的第一个类病毒是马铃薯纺锤形块茎病类病毒(Potato spindletuber viroid，PSTV)，这是一种导致马铃薯严重减产的病原体，棒状，无蛋白外壳。它仅含一个由359个核苷酸组成的单链环状RNA分子(相对分子质量约100 000)。该分子内有很多碱基(70)通过氢键配对而形成双螺旋区，未配对碱基则形成内环。双螺旋区与内环交替排列形成一个伸长的棒状分子。 类病毒RNA相对分子质量虽小，但能独立侵染寄主，侵入寄主后也能自我复制，不需要辅助病毒。二、拟病毒 一类被包裹在植物病毒粒体内部的类病毒，被称为拟病毒。拟病毒含有两种RNA分子，一种和

12、一般病毒中的类似，另一种RNA分子与类病毒有相似的理化性质和结构，也是环状的。不过这两种RNA分子单独都不表现致病性，只有联合起来才具有复制和感染性。这种类似类病毒的RNA称之拟病毒（Virusoid）。 又称蛋白质侵染因子。朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。羊瘙痒病是羊的一种中枢神经系统退化性紊乱疾病。表现为毛脱落，皮肤瘙痒，失去平衡和后肢麻痹等症状。这种“羊瘙痒病”的病原是经过近两个世纪的研究未能解决的一个谜。直至1982年，美国加洲大学旧金山分校动物病毒学家SBPrusiner发现羊瘙痒病是蛋白质侵染引起的疾病，并称为“Prion”即朊病毒。现在已经发现

13、与朊病毒有关的疾病有羊瘙痒病、貂脑病、人的库鲁病（震颤病）和克雅氏病。有人还推测人类的一些慢性退化性紊乱疾病，像早老年痴呆，帕金森氏病、糖尿病、风湿性关节炎和红斑狼疮等疾病也可能是由朊病毒引起的。三、朊病毒(prion) ：变态反应(allergy ) 定义：抗原或半抗原刺激机体产生细胞性和体液性免疫反应，当二次抗原再进来时发生了超敏反应，引起组织损伤。 分类：1、根据反应发生的快和慢来分：速发型，迟发型 2、1968年Gell和Coombs将变态反应分为、。 第一节 型变态反应（anaphylaxis） 一、动物过敏性休克二、人类的型超敏反应1、血清过敏性休克（serumanaphylaxi

14、s）举例：注射破伤风抗毒素（马血清）症状：病人不安，注射局部肿胀，鼻喉发痒，呼吸困难，血压下降，出冷汗，休克处理：一问，二试，三注射脱敏目的：避免组胺一次大量释放2、 药物过敏性休克举例：青霉素容易过敏的原因：1、遗传因素，家族史2、日常生活中自然致敏3、注射器未洗涤干净3、局部过敏反应1、食物过敏2、花粉、香料3、动物皮毛三、发病机理 型超敏反应的介质1、组织胺(histamin)生物学效应：作用十分短暂。增强毛细血管通透性，使支气管及其平滑肌发生收缩，并刺激黏液腺分泌。2、白三烯(srs-a)：生物学效应：作用慢而持久。平滑肌收缩，支气管哮喘。3、激肽（kinin）生物学效应;刺激平滑肌收

15、缩，对人支气管有很强的收缩作用，强烈的血管扩张作用，血压下降4、血小板活化因子（paf）生物学效应：活化血小板使其释放组织胺，引起毛细血管扩张和通透性增加嗜酸性粒细胞趣化因子（ecf-a）生物学作用：吸引嗜酸性细胞向局部聚集的趋化作用。5、5羟色胺（5ht）生物学活性与组织胺相似6、前列腺素（pg）生物学活性:血管扩张剂和支气管收缩剂 小 结1、 发作快2、 抗体是IgG3、 无补体参加4、 反应重，大多发生休克，出现全身或局部症状5、 和遗传有关，个体有差异6、 可以用抗体被动转移第二节 型变态反应 细胞毒型（cytotoxic type）一、特 点1、起因：由于中等大小可溶性免疫复合物沉积

16、2、致病：免疫复合物沉积在血管基底膜上，激活补体，吸引中性粒细胞及血小板聚集，造成血管炎症损伤。3、 抗体为IgG、IgM一、型变态反应的特点1、抗原：机体细胞本身或药物半抗原2、抗体：IgM,IgG3、补体参加4、被毒害的靶细胞：主要是血细胞，组织细胞5、结果：靶细胞融解，通过三条途径：吞噬， ADCC,补体激活 二、分 类（一）自身成分成为自身抗原1、 输血反应2、 新生儿溶血母亲为Rh()，第一胎是Rh()，第二胎是Rh()，导致溶血预防：第一胎分娩后72小时内，给母亲注射抗D-丙球蛋白产前诊断：孕妇血清中有无Rh抗体出生后诊断：有无黄疸、水肿、贫血（二）外源性抗原1、药物半抗原常引起过

17、敏性血细胞减少症非那西汀、对氨基水杨酸，青霉素，内毒素：溶血性贫血奎尼丁、氯霉素、磺胺、安替比林、保泰松：粒细胞减少症奎宁、奎尼丁、苯海拉明:血小板减少性紫癜2、 抗肾小球基底膜型链球菌感染后肾小球肾炎：A型溶血性链球菌与肾小球基底膜有共同抗原，易产生交叉反应三、发病机理第三节 型变态反应 免疫复合物型（immune complex type allergic reaction） 4、 抗原抗体比例A 抗原抗体比例合适，凝聚为不溶性免疫复合物，易被吞噬，不引起损伤。B 可溶性免疫复合物，体积微小者，在体内易通过血管壁渗出，易被血流冲走，无危害。C 抗原抗体比例不合适，形成中等大小体积者的抗原抗

18、体沉淀于血管壁，激活补体，吸引中性粒细胞，造成血管炎症损伤。二、发病机理（表）三、相关疾病1、 血清病第一次大剂量注射异种动物血清后，体内第7天就产生IgG、IgM抗体,而异种动物血清尚未完全清除，二者结合形成可溶性免疫复合物，随血流嵌入肾小球基底膜，关节滑液中，皮下组织毛细血管中。激活补体，吸引白细胞与血小板聚集，释放血管活性物质和溶酶体酶，引起肾小球肾炎。2、链球菌感染后肾小球肾炎链球菌M蛋白刺激机体产生抗体，再次感染时，链球菌抗原与已形成的抗体形成免疫复合物，沉积于肾小球基底膜，激活补体。3、类风湿性关节炎慢病毒感染，支原体侵犯关节滑液引起炎症。IgG进入关节与抗原形成复合物，被吞噬细胞

19、吞噬。水解酶损伤IgG,并释放出细胞。变性的IgG刺激机体产生抗体。其中的IgM抗体即Rh因子。4、 Arthus现象局部的抗体多于抗原，形成中等大小的免疫复合物，激活补体，产生过敏毒素，引起水肿，最终形成坏死性血管炎而导致溃疡。 第四节 型变态反应（delayed type allergic）一、 特点1、发作慢：致敏的机体再次接触抗原12小时才出现反应，2472小时至高峰2、细胞主导：T细胞起作用，无抗体、补体参加3、病变特点：单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润为主的；炎症病变 4、致敏的淋巴细胞释放的淋巴因子是细胞免疫中重要的物质基础，淋巴因子一般是对机体有利的，但过强会损伤组织。 二、发

20、病机制 三、 相关疾病1、传染病细菌：结核、伤寒、副伤寒病毒：腮腺炎、疱疹病毒、牛痘病毒真菌：白色念珠菌2、接触性皮炎接触的小分子化学物质药物、化妆品等和皮肤蛋白结合形成完全抗原致敏 青霉素皮试和结核菌素皮试的区别OT 青霉素 （马血清）原理型变态反应（迟发型）型变态反应（速发型）材料菌体蛋白 1：2000/0.1cc200单位/0.1cc 青霉素（马血清）20单位/0.1cc结果判读时间24-72h20阳性结果标准0.5cm红肿、硬结（致敏淋巴细胞浸润）红晕（境界不清，伪足状，周边发红，中间发白，水肿）阳性说明有型变态反应，有细胞免疫对青霉素过敏，不能使用阴性无细胞免疫，未感染过TB，接种卡

21、介苗对象第五节 变态反应的防治原则 1、 询问病史（过去史、家族史、接触史）、皮试 2、 寻找过敏源，避免接触3、 稳定细胞膜：色氨酸二钠等4、 提高CAMP的药物5、 抗组织胺：苯海拉明，扑尔敏6、 平喘解痉：麻黄素7、 降低毛细血管通透性：CaCl2，VC8、 钙离子拮抗剂：异搏定、硝苯吡啶等第四章 病毒 第三节 病毒的干扰现象与干扰素 干扰现象：两种病毒同时感染一个细胞，其中一种会抑制另一种病毒增殖的现象。干扰素定 义： 由病毒或其他IFN诱导剂诱导人或动物细胞产生的一类糖蛋白，它具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性种 类：种类产生细胞 抗病毒 抗肿瘤 免疫调节 人白细胞 强 弱

22、 弱 人成纤维细胞 强 弱 弱 T细胞 弱 强 强干扰素特性广谱性、种的特异性、间接性；抑制细胞分裂、分化及成熟；活化巨噬细胞及抑制细胞内寄生物IFN的诱生与抗病毒机理 IFN的诱生和作用示意图 早期中断病毒复制，阻止病毒扩散分期接种疫苗，避免干扰现象干扰现象的意义： 干扰素的副作用1.流感样综合征：患者发热、寒战、全身不适，肌痛、头痛等。 2.造血系统改变：抑制骨髓，降低外周血白细胞及血小板。3.消化系统反应：如食欲不振、味觉异常、恶心、呕吐、泄泻、腹胀等。 4.皮肤反应：用药超过4个月者的最常见副作用是轻、中度脱发，偶有停药后更严重者。 第四节 病毒的感染与免疫病毒的传播方式一、水平传播病

23、毒在人群不同个体间的传播病毒侵入机体的重要门户媒介昆虫叮咬感染呼吸道消化道动物咬伤感染接触感染登革热常见的症状1、发热所有患者均发热。2、皮疹于病程25日出现，初见掌心、脚底或躯干及腹部，渐延及颈部及四肢。3、出血于发病后5-8日，2550%病例有不同部位、不同程度的出血。 4、淋巴结肿大全身淋巴结可有轻度肿大及触痛。 5、其他可有肝脏肿大，脾大不常见，ALT升高 二、垂直传播通过胎盘或产道，病毒由母亲传给胎儿的方式胎盘流产病毒感染的播散方式1 局部播散2 经淋巴和血流播散3 经神经通道播散病毒的致病机理一、病毒对宿主细胞的直接作用 细胞水平上致病机理1、杀细胞性感染：多见于无包膜病毒 2、稳

24、定状态感染：多见于有包膜病毒 3、整合感染：多见于肿瘤病毒4、细胞凋亡5、细胞的增生和转化 二、病毒感染的免疫病理作用 机体水平上致病机理1、体液免疫的病理作用2、细胞免疫的病理作用3、免疫系统的功能被抑制感染的类型向外播散病毒 机体获得特异性免疫急性感染 持续性感染 隐性感染显性感染慢性感染： 病程长 病毒可检出 如HBV潜伏感染：经感染后，病毒基因存在于组织细胞中，可反复激活，急性发作病毒只有在急性发作时才被检出如 HSV、ZVZ慢发病毒感染：潜伏期长，发病后为亚急性进行性直至死亡寻常病毒非寻常病毒 持续性感染 第五节噬菌体噬菌体（bacteriophage , phage） 是感染细菌、

25、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的 病毒 具有病毒的特性：个体微小，可以通过细菌滤器，电镜观察没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成专性细胞内寄生的微生物噬菌体噬菌体与宿主菌的关系 宿主细胞溶解（溶菌反应） 两种结局 宿主细胞呈溶原状态（溶原性反应） 毒性噬菌体 溶菌反应 两种噬菌体 溶菌反应 温和噬菌体 溶原性反应毒性噬菌体（virulent phage） 概念：能在宿主菌细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体， 并最终裂解细菌的噬菌体。完成溶菌周期复制周期： 吸附 穿入 生物合成 组装与释放 毒性噬菌体复制周期噬菌现象液体培养基 混浊 澄清固体培养基中，出现噬斑（plaque）温和噬菌体（temp

26、erate phage） 概念： 噬菌体基因与宿主菌染色体整合，不产生子代 噬菌 体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分 裂而传代。该种状态称溶原状态。该噬菌体称 温和噬 菌体。 前噬菌体（prophage）：整合在细菌基因组中的噬菌体基因 溶原性细菌（lysogenic bacterium）：带有前噬菌体基因的 细菌 完成溶原周期, 诱导条件下完成溶菌周期溶原性转换 某些前噬菌体可导致细菌基因型和性状发生改变溶原性周期和溶菌性周期 发生整合的噬菌体基因可随细菌基因的噬菌体基因传给子代细菌，该过程称之为噬菌体的溶原性周期。在一定条件下，细菌的溶原状态可自发停止，噬菌体进入溶菌周期，

27、产生许多子代噬菌体，导致细菌裂解，称为溶菌性周期。温和噬菌体有溶原性周期和溶菌周期 毒性噬菌体则只有一个溶菌性周期溶原性细菌具有的特征 该菌的某些生物学性状发生改变 例： 带有-棒状杆菌噬菌体的白喉棒状杆菌 产生 白喉外毒素 噬菌体的应用细菌的鉴定与分型分子生物学研究的重要工具作为局部感染的辅助治疗研究病毒的意义 1.噬菌体可以作为防治某些疾病的特效药，例如烧伤病人在患处涂抹绿脓杆菌噬菌体稀释液 2.在细胞工程中，某些病毒可以作为细胞融合的助融剂，例如仙台病毒 3.在基因工程中，病毒可以作为目的基因的载体，使之被拼接在目标细胞的染色体上 4.在专一的细菌培养基中添加的病毒可以除杂 5病毒可以作

28、为精确制导药物的载体 6病毒可以作为特效杀虫剂 7病毒还在生物圈的物质循环和能量交流中起到关键作用 8病毒还可以用来治疗疾病，比如癌症 病毒的细胞培养赵健乔一 基本原理二 细胞培养的基本概念三 主要优点四 培养实验用品的前期处理五 培养细胞的生长方式及类型六 细胞培养的实验步骤七 病毒的细胞培养一 基本原理通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70保存备用。细

29、胞培养的基本概念传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。二 主要优点 研究的对象是活的细胞。 研究的条件可以人为的控制。 研究的样本，可以达到比较均一性。 研究的内容便于观察、检测和记录。 研究的范围比较广泛。 研究的费用相对较经济。三 分类原代细胞培养传代细胞培养原代细胞培养概念：从供体获取组织细胞后在体外进行的首次培养。优点：生物学特性未发生很大变化，细胞染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒学方面的实验缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。传代细胞培养概念：原

30、代细胞经过一系列传代，产生变异，转化为能够连续传代的细胞。传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可以通过人工驯化获得。常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等 四 培养实验用品的前期处理1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿2.包装3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。（2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.27.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。（3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为025，pH值7.2

31、左右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 002，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 (4) 培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无

32、机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子激素促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加10血清对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、

33、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。（6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 Uml，链霉素100Uml（青霉素为80万U瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。（7）冻存液：二甲基亚砜（8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方： 基础培养基 8090 血清 10% 双抗 100u/ml （9）细胞维持液：用以维持细

34、胞缓慢生长或不死的培养液。其是配方： 基础培养基 95 血清 25 双抗 100u/ml 五 培养细胞的生长方式及类型 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板悬浮生长型细胞六 细胞培养的实验步骤1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养（1）取胚选取9-11日龄SPF鸡胚，

35、大头朝上直立于蛋架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。（2）组织处理用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀将鸡胚剪成碎块。（3）消化用PBS液充分冲洗组织碎块2-3次，加入3-5倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分钟，每隔2-3分钟轻轻摇动一次。待组织碎块聚合成团，边缘毛样模糊时取出，轻轻吸取上层消化液，加适量DMEM培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散。（4）分装、培养将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中加入到10ml DMEM，充分混匀

36、，让细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温箱中培养。2传代细胞的培养（1）细胞的复苏（2）细胞的传代（3）细胞的换液（4）细胞生长状况的观察（5）细胞的冻存（1）细胞的复苏概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。操作步骤 准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。 从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻存盒内取出的冻存管（安瓶）应直接投入37温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融化。 从37水浴中取出冻存管或安瓶，离心1000r1min,用酒精消毒后开启，用滴管吸出上清

37、液，注入培养液1ml充分混匀，转入刻度离心管制成细胞悬液后低速离心，除去上清液，必要时再重复用培养液洗一次。 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次日更换一次培养液。继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。细胞复苏时细胞数可以做1020倍稀释，接种密度以5105 ml为宜。（2）细胞的传代原理 在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。操作步骤

38、 将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细胞从培养瓶壁上吹下来 然后进行传代消化传代的步骤（3）细胞的换液原理： 当细胞的量很少，未能铺满整个生长表面，但细胞培养液的pH值已经发生很大变化；或者是细胞形态很差等情况时，需要给细胞换液。操作步骤 （1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培养液 （2）加入PBS溶液清洗细胞瓶五面 （3）加入足量的细胞生长液，放入37、5%

39、CO2培养箱静置培养。（4）细胞生长状况的观察原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相应的措施处理。 肉眼观察 显微镜观察（5）细胞的冻存传代细胞应有充足的冻存储备。一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。二则防止细胞因传的代次太多，造成细胞衰老或细胞发生变异。细胞冻存方法（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min，弃上清。（2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传代及冻存日期。（3）冷冻保存：将冻存管于4放置30mi

40、n，然后移入-80超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先为每分钟下降速度1-2，当温度达到-25时，可调整下降速度为每分钟5-10，温度降至-100时，再放入液氮罐中长期保存。七 病毒的细胞培养以禽流感感染鸡胚成纤维细胞为例。（1）病料的处理（2）病毒分离、繁殖（3）细胞病变的观察（4）效价测定（5）中和实验（1）病料的处理 采集疑是感染禽流感禽的心、脑、肺、淋巴结在含有双抗的PBS液中研磨，4过夜，3000r/min离心10min，上清通过0.22m抽滤（2）病毒分离、繁殖1 将病毒液稀释成多个浓度分别接种在鸡胚中，鸡胚死亡后收集尿囊液。取效价最高的尿囊

41、液接种细胞。2 将长成单层致密的鸡胚成纤维细胞液倒掉，用PBS反复清洗3次，将死亡或脱落的细胞洗掉3 取0.5ml处理好的禽流感病毒液注入细胞瓶内，使病毒液充分铺满瓶底4 将接种病毒后的细胞瓶置于培养箱中感作45 min，将感作后的细胞瓶补加4.5ml营养液后置于温箱中培养5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从细胞中释放出来 正常形态的鸡胚成纤维细胞接毒后发生病变的鸡胚成纤维细胞（4）效价测定 某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。病毒增殖技术 动

42、物增殖病毒技术禽胚增殖病毒技术细胞增殖病毒技术一、动物增殖病毒技术 选择动物的标准：大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康(经临床检查、检疫)；对相应病毒易感，并十分敏感；经隔离饲养和观察检查证明健康；家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准；体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。 二、禽胚增殖病毒技术（一）禽胚的选择 SPF鸡胚 据国家标准，无22种特定病原体 非免疫鸡胚 应无特定病原的母源抗体， 普通鸡胚 可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚（二）禽胚

43、接种途径与收获 绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 羊膜腔接种法 静脉接种法 脑内接种法鸡胚绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 尿囊液收获方法 鸡胚卵黄囊接种法1种蛋质量病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、支原体及传染性贫血因子等。母源抗体：抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体 2孵化技术温度：3739.5。传染性支气管炎病毒37 湿度：鸡胚5357，水禽胚比鸡胚高510。通风：氧气，二氧化碳。 翻蛋：（三）影响禽胚增殖病毒的因素3接种技术 不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。接种日龄：鸡胚1314日龄。鸭胚1516日龄，尿囊液含 量

44、最高，平均约68ml，羊水约12ml。接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育严格防止禽胚污染 鸡胚接种时严格无菌操作； 定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； 种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。三、细胞增殖病毒技术 1细胞培养的概念 细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 原代细胞(primary cell) 细胞株(cell strain) 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)（1）原代细胞(primary cell) 指由

45、新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞 指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很多代(50100代)，但为有限生命；没有肿瘤原。如PKl5、BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line) 能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系 静置培养 转瓶培养悬浮培养(suspension cell culture ) 微载体培养(microcarr

46、ier cell culture) 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 微囊化细胞培养2细胞培养方法悬浮培养 通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。 微载体培养微载体直径应为60105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动

47、化装置。细胞产量达106107个/m1，每升培养液可加微载体25g，每克有80009000个珠子，培养面积约为25万cm2，比常规培养面积大1025倍。 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯丙烯复合物或多聚碳酸硅等材料制成，外径50100m，壁厚2575m，壁呈海绵状，上面有很多微孔。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有滞留作用。培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高度活性，培养的细胞密度大，细胞

48、分泌的蛋白质浓度高，纯度可达6090；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。 培养液血清细胞接种量pH温度无菌条件培养器皿清洁度3. 细胞培养要素RPMI-1640、199、DMEM、F12 血清成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。-珠蛋白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋白和脂蛋白G2能促进细胞贴壁。血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56灭活30min，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为520。维持液中血清量为0%5。血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮

49、生长因子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清培养液须补加38种血清替代因子。细胞接种量 细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少，这些物质分泌量少，而作用也小。接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多对细胞生长也不利。鸡胚成纤维细胞为100万m1小鼠或地鼠肾细胞为50万m1猴肾细胞量为30万ml传代细胞为1030万m1(1) 细菌污染(2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培养液中可见黄白色小点状悬浮物 镜检时可见菌丝结构。 (3) 支原体污染：污染率为5060(4) 病毒污染 组织带毒 培养液带毒4细胞培养

50、污染问题（1）血清 ：维持液内犊牛血清含量一般不超过2。（2）温度：狂犬病病毒32，犬疱疹病毒36。（3）pH：（4）病毒接种剂量：应以TCID50为依据 一般按维持液的110(VV)量接入。 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。5. 细胞培养病毒要素6. 病毒增殖指标与收获细胞病变(CPE)：细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等；细胞聚合，如腺病毒；细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒；轻微病变，如正粘病毒、冠状病毒等。包涵体和血凝性：也可作为检查病毒增殖的指标。 有些病毒不产生CPE。病毒收获：C

51、PE达80时收获，反复冻融多次使病毒释放， 然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20保存。病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA疫苗制造工艺流程病毒性细胞疫苗制造工艺流程 病毒性组织疫苗制造工艺流程细菌疫苗和类毒素制造工艺流程 寄生虫疫苗制备的工艺流程 常见致病病毒（一）呼吸道病毒呼吸道病毒的定义 指侵犯呼吸道，引起呼吸系统和/或呼吸系统外组织器官病变的病毒呼吸道病毒的种类及引起疾病核酸类型 病毒 科别 引起疾病RNA 流感病毒 正粘病毒 流行性感冒 副流感病毒 副粘病毒 感冒、支气管炎、肺炎 呼吸道合胞病毒 副粘病毒 感冒、支气管炎、肺炎 麻疹病毒 副粘病毒 麻疹 腮腺炎病毒 副粘

52、病毒 流行性腮腺炎 鼻病毒 副粘病毒 感冒、支气管炎 风疹病毒 披盖病毒 风疹 人冠状病毒 冠状病毒 感冒、咽炎DNA 人腺病毒 腺病毒 感冒、支气管炎、肺炎 结膜炎、咽炎、扁桃腺炎流行性感冒病毒流感病毒的生物学特性一、形态与结构二、培养特性三、抗原结构四、抵抗力五、分型形态与结构形态：球形、有包膜、核衣壳螺旋对称结构：核衣壳：核酸（单负链RNA、分节段） 核蛋白（NP） RNA多聚酶（PA、PB1、PB2）包膜：基质蛋白M1、M2 （内层） 镶嵌蛋白HA、NA（外层）甲型流感病毒结构模式HANAM1M2PB2PB1PANPRNAHANA甲型流感病毒(电镜）甲型流感病毒(新分离株）流感病毒神经

53、氨酸酶培养特性1、鸡胚接种：羊膜腔、尿囊2、细胞培养：猴肾原代、狗肾传代 感染细胞无明显病变，须以红细胞吸附、凝集 试验证实抗原结构1、核蛋白：稳定、具型特异性2、内膜基质蛋白：稳定、具型特异性3、HA、NA：甲型流感病毒易变异、构成亚型 抗原漂移（antigenic drift） 抗原转换（antigenic shift）甲型流感抗原转换与疾病流行流行年代 亚型类别 代表株 1918 Hsw1N1 1947 H1N1（亚甲型） A/FM/1/47 1957 H2N2（亚洲甲型） A/Singapore/1/57 1968 H3N2（香港甲型） A/HongKong/1/68 1977 H1N

54、1（新甲1型） A/USSR/90/77抵抗力1、弱、不耐热、56 30min杀灭 （-70 长期保存）2、对干燥、紫外线、乙醚、甲醛、 乳酸敏感分型 甲型 乙型 丙型疾病严重程度 + + +动物储毒 + 引起大流行 + 引起传播 + + 抗原调变 漂移、转换 漂移 漂移RNA节段 + + +一、传播方式二、所致疾病三、致病机制四、免疫性流感病毒的致病性传播方式侵袭呼吸道上皮细胞增殖引起细胞空泡变性坏死脱落所致疾病飞沫传播致病机制流感、肺炎、Reyes综合征免疫性1、细胞免疫：存在广泛的亚型间交叉反应2、体液免疫：同型病毒可形成牢固免疫力 亚型间无交叉反应流感病毒感染的诊断与防治一、微生物学检

55、查二、防治 标本类型：咽嗽液、鼻咽拭检测方法：病毒分离：鸡胚接种、细胞培养 血清学诊断：血凝抑制试验 病毒核酸测定：PCR微生物学检查防治疫苗：三价灭活疫苗治疗：抗病毒剂、中草药肠道病毒肠道病毒的分类关系小RNA病毒科肠道病毒属鼻病毒属脊髓灰质炎病毒柯萨奇病毒埃可病毒新肠道病毒甲型肝炎病毒肠道病毒的生物学特性一、形态与结构二、抵抗力形态与结构形态：球形、无包膜、 核衣壳20面体立体对称结构：核酸单正链RNA、不分节段 多蛋白水解为4个（VP1-VP4） VP1-VP3衣壳蛋白 VP4核蛋白脊髓灰质炎病毒结构模式VP1VP2VP3抵抗力1、强、耐酸、耐脂溶剂2、热、紫外线敏感肠道病毒的分型脊髓灰

56、质炎病毒 1、2、3型柯萨奇病毒A组 1-22、24型柯萨奇病毒B组 1-6型埃可病毒 1-9、11-27、29-33型新肠道病毒 68、69、70、71、72* 甲型肝炎病毒肠道病毒的致病性疾病 柯萨奇A组病毒 柯萨奇B组病毒 埃可病毒 新肠道病毒类脊髓灰质炎 7、9型 2-5型 2、4、6、9、11、30型 71型病毒性脑炎 2、4、7、9、10型 1-5型 4、6、9、11、16、30型 70、71型心肌、心包炎 4、16型 2-5型 2-6、9、11、16、18、25型呼吸道感染 9、16、21、24型 1、3-5型 4、9、11、20、25型 68型消化道感染 1、2型 1-3、6-

57、7、11-12、18-19型流行性结膜炎 24型 1、5型 7型 70型疱疹性咽峡炎 2、4-6、8、10、16型手足口病 2、6、8、10、16型肝炎病毒肝炎病毒的定义 指以侵犯人类肝细胞为主，只引起肝炎的病毒肝炎病毒的类型病毒 病毒科 核酸类型 传播方式HAV 小RNA病毒 正单链RNA 粪-口HBV 嗜肝DNA病毒 双链DNA 输血HCV 黄病毒 正单链RNA 输血HDV 负单链RNA 输血HEV 杯状病毒 正单链RNA 粪-口HFV 粪-口HGV 黄病毒 正单链RNA 输血TTV 细小病毒 负单链DNA 输血肝炎病毒的传播方式1、粪-口：HAV、HEV、HFV（流行性）2、输血、垂直：

58、HBV、HCV、HDV、 HGV、TTV（散发性）乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒的生物学特性一、形态与结构二、培养特性三、抵抗力四、抗原结构乙型肝炎病毒的三种颗粒小球型颗粒管型颗粒Dane 颗粒乙型肝炎病毒（电镜）Dane 颗粒三种颗粒形态与结构1、形态：大球形颗粒Dane颗粒 小球型颗粒无核酸及DNA多聚酶 管型颗粒同小球型颗粒2、结构：核酸双链DNA、长（负）链、短（正）链 S区：编码preS1、preS2、HBsAg C区：编码preC、HBcAg X区：编码HBxAg（调控蛋白） P区：编码DNA多聚酶 蛋白：衣壳HBcAg组成 包膜含大分子、中分子、小分子三种蛋白C 区X 区S 区P 区乙

59、型肝炎病毒基因结构模式正链负链重复序列乙型肝炎病毒结构模式大分子膜蛋白中分子膜蛋白小分子膜蛋白培养特性1、动物接种：黑猩猩2、细胞培养：肝癌传代 抵抗力1、100。C 10min、0.5%过氧乙酸灭活2、耐干燥、紫外线、低温抗原结构1、HBsAg：共同决定簇a 型特异决定簇 d/y w/r 四种亚型：adr、adw、ayw、ayr2、 HBcAg：衣壳抗原3、 HBeAg： 分e1、e2、e3乙型肝炎病毒的致病性与免疫性一、传播方式二、所致疾病三、致病机制四、免疫性传播方式1、输血传播2、性接触传播3、垂直传播4、口-口传播（唾液检测HBV-DNA）致病机制病毒直接损伤感染后免疫损伤整合感染所

60、致疾病急性肝炎爆发型肝炎慢性肝炎免疫性1、保护性免疫 抗HBsAg抗体主要中和抗体 针对HBeAg的细胞免疫是清除病毒的主要机制2、免疫损伤 针对HBsAg、 HBcAg、 HBeAg的细胞免疫造成肝细胞损伤 抗HBsAg抗体可致免疫复合物损伤乙型肝炎病毒感染的诊断与防治一、微生物学检查二、防治 标本类型：血清检测方法：血清学诊断：“两对半”测定 病毒核酸测定微生物学检查HBV抗原、抗体的形成及意义0 1 2 3 4 5 6 7 8 （月）窗口期HBsAgHBeAgAnti-HBsAnti-HBeAnti-HBc潜伏期急性期恢复早期恢复晚期HBV抗原、抗体检测的临床意义HBsAg HBeAg