高效液相色谱法测定左亚叶酸钙注射液有关物质的条件研究

1、高效液相色谱法测定左亚叶酸钙注射液有关物质的条件研究【摘要】目的创立左亚叶酸钙注射液有关物质测定要领。要领接纳反相离子对试剂高效液相色谱法，色谱柱为Varian182504.6,5，活动相：磷酸氢二钠2.2g加10%四丁基氢氧化铵8l，以水稀释到780l，用110磷酸调治pH至7.8:甲醇为78:22；流速：1.0l/in；柱温：40；检测波长286n。结果左亚叶酸钙质量浓度为0.04120g/l内，线性干系精良r=0.9999。结论要领专属性好，正确，敏捷，用于左亚叶酸钙注射液有关物质测定结果可靠。【关键词】高效液相色谱法；左亚叶酸钙注射液；有关物质；10甲酰叶酸【Keyrds】HPL；al

2、iulevfliaidinjetin；relatedsubstane；10-frylfliaid左亚叶酸钙注射液是接纳经手性拆分亚叶酸钙后所得左亚叶酸钙质料药配制而得的一种手性药物注射剂。其普及用于血虚、肿瘤的治疗。该品种是安徽省科隆药物研究所研制的一个新药。原有的HPL有关物质测定要领色谱条件为：18柱2504.6,5,流速1.0l/in，柱温：40，活动相：磷酸氢二钠2.2g加10%四丁基氢氧化铵2l，以水稀释到780l，用110磷酸调治pH至7.5:甲醇为78:22，供试液浓度：0.14g/l。但是在用该色谱条件举行测定左亚叶酸钙注射液有关物质时，创造杂质峰没能得到基线分散，且不克不及检

3、测到杂质10甲酰叶酸。按照同系物HPL色谱条件相近原那么，参考?中国药典?12022年版注射用亚叶酸钙冻干粉针有关物质测定色谱条件及?欧洲药典?2左亚叶酸钙质料药有关物质测定色谱条件，在此底子上用四点法求出容量因子对离子对试剂浓度和pH值的回归多项式，进而求得活动相离子对试剂浓度和pH值的最正确值。1仪器与试剂1.1仪器Agilent1100液相色谱仪，包罗Agilent色谱事情站，单位泵，可变波长紫外检测器，外配AT-130柱温箱，TU-1800紫外可见分光光度计。1.2试剂甲醇：色谱纯。磷酸氢二钠，10%四丁基氢氧化铵水溶液，磷酸，均为阐发纯。左亚叶酸钙比较品含量99.2%，水分17%，批

4、号20221029;亚叶酸钙消旋体含量99.2%，水分11.7%，批号20220820;10甲酰叶酸?美国药典?成认尺度品，含量99.5%。左亚叶酸钙注射液本公司消费，批号050701，50g/5l。2色谱条件色谱柱：Varian182504.6,5;流速：1.0l/in;柱温：40;检测波长：286n;进样量：20l。3四点法求出各组分峰相应面多项式按Shenakers公式组分的容量因子k的对数和常用色谱参数活动相中强溶剂的比例，pH值，柱温-1等呈一次或二次线性干系3，对二参数即二因子体系可接纳以下公式Lnk=0+1x1+2x2+12x1x2，在本实行中把公式定为Lnk=A+B+pH+Dp

5、H此中A、B、D为多项式的不决系数，为离子对试剂浓度g/l，pH为活动相终极pH值，按照亚叶酸钙有关物质测定HPL色谱条件为0.8g/l，pH为8.28，取用浓度为0.1g/l的左亚叶酸钙注射液水溶液用该色谱条件举行有关物质测定，色谱图见图1。略创造各杂质峰根本能得到基线分散，并能检测出10甲酰叶酸杂质峰，设定另三个实行点为：0.8g/l，pH：8.14，：1.13g/l，pH：8.28，：1.13g/l，pH：8.14。按k=t-t0/t0，盘算出4个实行点各组分峰的k，代入Lnk=A+B+pH+DpH，求出9个峰的容量因子k相应面多项式为：Lnk1=-33.63566+27.13161+4

6、.04900pH-3.34589pHLnk2=-17.41685+14.07742+2.08591pH-1.71515pHLnk3=-16.72214+13.46845+1.99667pH-1.61905pHLnk4=-11.47669+9.01227+1.36901pH-1.07591pHLnk5=-11.98090+8.9332+1.43346pH-1.06335pHLnk6=-9.79820+7.70891+1.17938pH-0.91020pHLnk7=-9.43013+6.88176+1.14269pH-0.80801pHLnk8=-8.84756+6.48648+1.08823pH

7、-0.75779pHLnk9=-6.72357+4.10918+0.84392pH-0.44892pH此中第五峰为最难分散物质对峰按：Lnk5=8.9332-1.06335pH0得pH=8.40Lnk5pH=1.4336-1.06335得=1.35g/l求得色谱条件中和pH的上限值为：1.35g/l，pH：8.40。在：1.35g/l，pH：8.28和：0.8g/l，pH：8.40条件下对左亚叶酸钙注射液举行有关物质的测定，综合比力已做的四个实行点色谱图，以：0.8g/l，pH：8.28和：1.13g/l，pH：8.28两个实行点得出的色谱图各峰均得到较好的分散。色谱图见图2。4要领专属性观察

8、4.1辅料的滋扰性实行按左亚叶酸钙注射液处方比例配制空缺样品，用水配制成.1g/l的溶液，汲取20l进样，记载色谱图见图3A，可见处方中的辅料对测定无滋扰。4.6光照粉碎实行取左亚叶酸钙注射液1支，置4500LX的强光下，安排10天，配制0.1g/l的水溶液，进样20l，记载色谱图见图3F。图2：1.13g/lpH：8.28所得左亚叶酸钙注射液色谱图Fig2aluiLevflinateInjetinHPLhratgrasf：1.13g/lpH：8.28图3要领专属性观察图谱Fig3HPLhratgrasftheexlutininspetinfethdA.空缺溶液blankslutin；B.比较

9、品溶液refereneslutin.氧化粉碎试验thexidativedestryedtest；D.酸粉碎试验theaiddestryedtestE.碱粉碎试验thebasedestryedtest；F.光照粉碎试验thelightdestryedtest5线性干系观察称取5.03g10甲酰叶酸至50l容量瓶内，用活动相定容至刻度作为母液，别离量取母液配制成含10甲酰叶酸0.1、0.2、0.5、1、2、4g/l的水溶液，别离取20l进样，每个样品各进样3次，盘算峰面积的均匀值，3次峰面积的RSD均小于2%，以峰面积A为纵坐标，浓度，g/l为横坐标，举行回归处置惩罚，尺度曲线方程为A=28.81

10、2-0.63894，r=0.9999。在0.14.0g/l浓度范畴内线性干系精良。称取左亚叶酸钙尺度品含量99.2%，水分17%，用水配制成含左亚叶酸钙120、100、4、2、1、0.04g/l的水溶液，别离取20l进样，每个样品各进样3次，盘算峰面积的均匀值，3次峰面积的RSD值均小于2%，以峰面积A为纵坐标，浓度，g/l为横坐标，举行回归处置惩罚，尺度曲线方程为A=79246.3+0.058548，r=0.9999。在0.04120g/l浓度范畴内线性干系精良。6加样接纳率安徽省科隆药物研究所提供的有关物质测定要领中，有杂质10甲酰叶酸的含量限定。参考?欧洲药典?左亚叶酸钙质料药有关物质测

11、定要领和?中国药典?2022年版二部注射用亚叶酸钙有关物质测定要领，将左亚叶酸钙注射液有关物质测定要领中供试液的浓度定为0.1g/l。取左亚叶酸钙注射液和10甲酰叶酸尺度品配制成浓度为0.05g/l的供试液及0.001g/l的比较液，别离进样。按照供试液和比较液色谱图中10甲酰叶酸峰的面积，用上述供试液和比较液，别离配制10甲酰叶酸含量相对尺度50%、80%、120%的供试液各3份，每份进样3次，盘算得均匀加样接纳率n=3别离为：106.9%、110.0、108.4%，RSD别离为1.68%、1.19%、0.46%。7细密度及溶液不变性实行用左亚叶酸钙注射液和10甲酰叶酸比较品配制成浓度别离为

12、0.1g/l和0.001g/l的溶液，一连进样6次，RSD别离为1.51%和0.43%，取上述溶液室温安排，别离于0、2、4、8、12、24h取样测定，峰面积的RSD别离为：1.10%、0.80%。表白左亚叶酸钙注射液水溶液和10甲酰叶酸水溶液在室温下安排24h不变性精良。8白天细密度和重复性实行用左亚叶酸钙注射液配成0.1g/l的水溶液6份和0.001g/l10甲酰叶酸尺度品水溶液6份，别离进样20l，有关物质总量别离为2.30%、2.30%、2.31%、2.31%、2.30%、2.30%，10甲酰叶酸量为限度的0.64%、0.70%、0.69%、0.70%、0.67%、0.65%，RSD为

13、0.22%、3.83%。取上述溶液别离在1、5、10天内由差异职员别离进样，测得10甲酰叶酸和有关物质总量别离为0.64%、0.69%，0.65%、2.30%，2.30%、2.31%，RSD别离为4.0%、0.25%。92022年版?中国药典?和?欧洲药典?及本次实行要领差异性阐发?欧洲药典?2022年版有左亚叶酸钙质料药有关物质的测定，无制剂的测定要领。?中国药典?2022年版只有亚叶酸钙质料、冻干粉针有关物质的测定，左亚叶酸钙质料及制剂尚未上2022年版?中国药典?。?中国药典?和?欧洲药典?对亚叶酸钙和左亚叶酸钙有关物质测定都接纳溶液浓度1g/l，280n的检测波长，?中国药典?接纳自身

14、比较，?欧洲药典?接纳亚叶酸钙尺度品作为比较而进样量那么为10l。?欧洲药典?和本次实行接纳的10甲酰叶酸比较液的浓度别离为0.005g/l和0.001g/l，限度均为小于比较液的0.8倍,?中国药典?无10甲酰叶酸限度项。笔者按照上述条件及本人本次实行所接纳的条件，别离接纳280n，286n检测波长和左亚叶酸钙供试液浓度0.1g/l和1g/l及10l、20l进样量举行测定，所得结果如下。表1差异波长、供试液和进样量所得10甲酰叶酸和有关物质总量略从上述结果可以看出接纳左亚叶酸钙注射液供试液浓度0.1g/l及进样量10l，检测波长280n、286n所得数据差异较小，而接纳1g/l20l进样量时

15、所得数据差异较大，这是由于1g/l10甲酰叶酸在280n出现汲取峰，0.001g/l左亚叶酸钙、0.01g/l亚叶酸钙消旋体在286n处出现汲取峰之故。10讨论在确定了活动相强溶剂比例、柱温、流速等参数后，对利用离子对试剂的活动相体系，在离子对试剂浓度及pH值为不决因子时可通过对用Shenakers公式导出的最难分散物质对色谱峰相应面多项式求偏导数的要领，求出离子对浓度和pH值的上边界值，进而接纳体系优化的要领求出最正确活动相构成。该要领大概对不具有体系优化软件的企业来说不失为一种探求高效液相色谱最优条件的要领4。接纳反相离子对试剂体系测定极性化合物的有关物质时，同比例缩小离子对试剂和供试液浓度，不克不