核医学教学课件：体外放射分析技术

1、体外放射分析技术 定 义以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术激素，肿瘤标志物，药物浓度，病毒抗原等 体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术 具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点优 点体外分析技术体外放射分析体外非放射分析放射性竞争结合分析放射性非竞争结合分析放射免疫分析 (RIA)免疫放射分析酶免疫分析化学发光免疫分析荧光免疫分析(IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)定 量 手 段放射性测量技术酶定量技术化学发光

2、定量技术生物学基础特异性结合反应： 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应；结合体对： 抗原-抗体激素-激素结合球蛋白受体-配体第 一 节放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA) 在体外条件下, 利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术概 念历 史1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel奖 Dr. Yalow 基 本 原

3、理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag(B)(F) *Ag与Ag 免疫活性相同*AgAg Ab*Ag 与 Ab的量一定反应可逆B与F可分离Ag= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag 90%2）半衰期足够长3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3H or 125ISpecific binding reagent 特异性结合剂 抗 体特异性(specificity)：不受交叉反应的程度 亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合的程度，是反映结合剂质量的主要指标。可用亲和力常数（将1mmolAb稀释到

4、多少升时能使Ag的结合率下降到50%）表示 滴度(titer)：表示Ab的最适宜稀释度。在RIA时，结合50%的标记配体的结合剂稀释度；IRMA分析要求较高滴度（过量）Separation technique 分离技术 免疫分离法：利用抗原抗体结合形成的复合物 化学分离法：PEG等 物理分离法：电泳、层析、离子交换、活性炭 或树脂吸附等 生物分离法：葡萄球菌A蛋白（SPA） 固相分离法：包被试管、塑料球、磁化分离技 术等。分离方法第二抗体 优点：特异性强，分离效果好，适合自动化。 缺点：二抗用量大，成本高，两次温育，操作时间长双抗体法沉淀法 吸附法 固相法中性盐和有机溶剂 硫酸钠，硫酸铵及聚乙

5、二醇（PEG)等优点：来源容易，价格便宜，分离快速，不需二次温育。 缺点：结果易受T,PH,试剂浓度等因素影响。活性炭 硅酸盐 离子交换树脂 优点：简单，快速，经济，材料来源广。缺点：专一性差，影响因素多 免疫吸附法 优点：固相材料来源广，价格低，分离不用离心，简单，快速。 缺点：制备固相试剂费时，费事；抗体活性的回收率低；大分子抗体与固相连接时会造成亲和力下降，灵敏度受影响分离方法的要求分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、PH值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 质量控制就是使用合适的方法以检查、表

6、示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。 具体作用有： 1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。 2识别误差的来源并消除其原因。 3改进测定方法的设计以提高质量。 Quality control 质量控制 A.反映测定精度的质量指标平均批内变异系数(C.V) 反应误差关系(RER) 精密度图 B.反映测定稳定性的质量指标及其影响因素零标准管结合率(Bo) 非特异性结合率(NSB) 反映标准曲线的质量：截距(a)、斜率(b)、相关系数(r)及有效剂量ED25、ED50、ED75等 Quality control 质量控制C.反映测定标准准确度的质量指标 回收率测定 二

7、样本Youden图 D.反映测得方法灵敏度的质量指标用最低可测浓度表示测，是指能与不含有标准配体的零标准管的测定结果在统计学上区别开来的最低浓度。累计多批测定结果，计算出Bo%的平均值和标准差，经减去2倍SD后的结合率，从标准曲线上查出其对应的浓度，即为最低可测浓度基本操作步骤加样 温育 分离 放射性测量 绘制标准曲线 查待测物含量 基本操作步骤加样零标准管 1 23 4 5 6 待测管100l缓冲液100lAFP10ng/ml100lAFP25ng/ml100lAFP50ng/ml100lAFP100ng/ml100lAFP200ng/ml100lAFP400ng/ml100l待测血清100

8、l125I-AFP100lAFP抗体基本操作步骤温育 充分摇匀56C水浴10min -20 C冰箱10min分离加分离试剂500l充分摇匀室温放置15min离心3500转/min，离心15min弃上清后测沉淀放射性计数绘制标准曲线 查待测物含量基本操作步骤RIA 小 结灵敏度高特异性好精确的定量方法操作简便 第二节 免疫放射分析法（immunoradiometric assay,IRMA）*Ab+Ag-*Ab + *AbB%Ag（B）（F） 在体外, 利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。基 本 原 理IRMA与RIA工作原

9、理的主要区别RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗体三种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测Ag的量呈负相关Ag*Ab的量与待测Ag的量呈正相关反应到达平衡慢反应到达平衡快非特异结合主要影响高剂量区非特异结合主要影响低剂量区低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素B%B%拟合的标准曲线拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的NSBIRMA的标准曲线及非特异结合曲线RIA的标准曲线及非特异结合曲线IRMA和RIA低剂量区的不确定因素示意图RIA+或01IRMA+1非放射性标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术化学发光免疫

10、分析技术时间分辨荧光免疫分析技术一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。 ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。 二、化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术是以化

11、学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。 1.化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。 2.化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物-金刚烷，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。 3.电化学发光免疫分析(略) 4.生物发光免疫分析(略)

12、 三、时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。标记物为具有独特荧光特性的稀土金属镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 : 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te）镧系元素荧光重要特点： 1. 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2. 200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes

13、位移为273nm 3. 狭窄的发射峰 4. 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）一、基本原理镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te）Eu+EuEu+增强液+Eu“解离增强镧系荧光免疫分析”时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰退时间铕：730000 ns钐：50000 ns一般荧光物质：10 ns铕的荧光二、TrFIA的特点1. 最大限度提高测量方法的灵敏度2. 有与RIA相似的特异性和精密度3. 可同时测定两种以上的抗原4. 无辐射污染DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨波长分辨将特异性荧光与非特异性荧光分离开零背景高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好低分子量原子标记标记位点多可达20个对标记物的结构与活性影响小无衰变受环境影响小灵敏度更高高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单，双，三，四标记一个试剂盒可同时测多个项目总结： 体外分析的发展方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析标记物的改变：放射性核素 荧光、酶、化学发光、稀土