高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸含量的研究

1、高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸含量的研究【摘要】目的建立甘草苷和甘草酸的HPL含量测定方法。方法使用KrasiL-184.6200，5柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸(20:80)为流动相，检测波长276n，柱温为室温；甘草酸流动相为甲醇-0.2lL-1乙酸铵溶液-冰乙酸(67321)，检测波长252n，柱温为室温。二者流速均为1.0lin-1，采用外标法定量测定。结果甘草苷在2.727gl-1范围内呈良好线性关系r=0.9997；甘草酸在636gl-1范围内呈良好线性关系r=0.9998；甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为101.4%和101.3%，其RSD值分别为1.18%和1.22%。结

2、论该方法操作简便、准确，线性相关系数良好，且稳定性和重复性好，适用于甘草黄酮粗提物及纯化物中甘草苷和甘草酸的含量测定。【关键词】高效液相色谱；甘草苷；甘草酸Abstrat：bjetiveTestablishethdfrdeterinatinfliquiritinandglyyrrhiziaidbyHPL.ethdsKrasil-18lun(4.6200,5)asused,HPLanalysisfrliquiritinasperfredithrteperatureandthebilephasensistedfaetnitrile-0.5%glaialaetiaid(2080),thedeteti

3、navelengthasat276n;HPLanalysisglyyrrhiziaidasperfredithrteperatureandthebilephasensistedfethanl-0.2lL-1aniuaetate-glaialaetiaid(67321),thedetetinavelengthasat252n.Theflrateas1.0lin-1.ResultsThelinearrangefliquiritinasbtainedbeteen2.727gl-1(r=0.9997);thelinearrangefglyyrrhiziaidasbtainedbeteen636gl-1

4、(r=0.9998);theaveragereveryfliquiritinandglyyrrhiziaidere101.4%and101.3%respetivelyithrrespndingRSDf1.18%and1.22%.nlusinThisethdissiple,nvenientstable,repeatableandaurateithgdlinearrelatinship.Itissuitablefrthedeterinatinfliquiritinandglyyrrhiziaidinextratinandpurifiatinflirieflavnid.Keyrds：HPL；Liqu

5、iritin；Glyyrrhiziaid甘草是新疆蕴藏量大、药用价值高的一种荒漠草原药用植物，其主要有效成分为甘草酸和黄酮类化合物。甘草黄酮具有明显的抗肿瘤、抗溃疡、抗菌、抗变态反响、降血脂和镇痛的作用，并对爱滋病病毒有很强的抑制增殖作用1，2，是甘草有效成分开发的热点。经典的黄酮含量测定方法，是以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定35，但此方法用于甘草黄酮的测定尚有诸多缺乏之处。甘草黄酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黄酮内在质量的一个重要指标6。本研究以甘草苷为对照品，采用HPL法测定甘草黄酮含量的方法，同时研究优化以HPL测定甘草酸含量的方法，以期为甘草有效成分的综合开发利用和质量监控提供

6、新的方法和思路。1仪器与材料1.1仪器L-10A高效液相色谱仪(日本岛津)；SPD-10A可变紫外检测器(日本岛津)；万分之一天平Sartrius；KQ-250B型超声波清洗器(上海之信仪器)。1.2材料甘草(石河子天德中药厂)。甘草苷对照品、甘草酸单铵盐对照品(均购自中国药品生物制品检定所)；95%乙醇(A.R)、冰醋酸(A.R)、乙酸胺(A.R)、甲醇色谱纯、乙腈色谱纯。2方法与结果2.1色谱分析条件2.1.1甘草苷检测条件色谱柱为KrasiL-184.6200，5；流动相为乙腈-0.5%醋酸(2080)；紫外检测波长：276n；流速1.0lin-1；柱温为室温；进样量20l。理论塔板数按

7、甘草酸铵峰计算应不低于4000。对照品和甘草黄酮粗提物的色谱图见图12。2.1.2甘草酸检测条件色谱柱为KrasiL-184.6200，5；流动相为甲醇-0.2lL-1乙酸铵溶液-冰醋酸(67321)；紫外检测波长252n；流速1.0lin-1；柱温为室温；进样量20l。理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000。对照品和甘草黄酮粗提物别离的色谱图见图34。2.2对照品及供试品溶液的配制2.2.1对照品溶液的配制取甘草苷和甘草酸单铵盐对照品适量，精细称定，用流动相配制成浓度为54gl-1的甘草苷对照品溶液和120gl-1的甘草酸单铵盐对照品溶液。2.2.2供试品溶液的制备精细称取甘草黄酮提取物

8、适量，用相应的流动相溶解，定溶于10l量瓶中,作为甘草苷供试品溶液。精细称取甘草黄酮提取物适量，用相应的流动相溶解，定溶于10l量瓶中，作为甘草酸供试品溶液。2.3检测波长的选择以流动相为参比溶液，在200400n波长范围内分别对甘草苷和甘草酸对照品溶液进展扫描，结果说明，甘草苷在276n处有一最大吸收峰，甘草酸在252n处有一最大吸收峰，所以选定276n为甘草苷的检测波长，252n为甘草酸的检测波长。2.4线性关系的考察精细汲取甘草苷对照品储藏液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00l于10l量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，摇匀；再精细汲取甘草酸单铵盐对照品储藏液0.50

9、，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00l于10l量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀；分别按“2.1项色谱条件进展测定，以峰面积AVs对进样浓度gl-1作回归统计，结果：甘草苷在2.727gl-1范围内线性良好，回归方程：A=24962+7161.1，r=0.9997。甘草酸在636gl-1范围内线性良好，回归方程为：A=23653+23125，r=0.9998。2.5精细度实验取同一供试品溶液，重复进样6次，求得甘草苷的RSD为0.74%，甘草酸的RSD为0.92%，说明本方法精细度良好。2.6重复性实验按“2.2.2项制备同一批号供试品溶液6份，按拟定的色谱条件分别测定甘草苷和甘草

10、酸的含量，测得甘草苷的RSD为1.32%，甘草酸的RSD为1.04%，说明重复性较好。2.7稳定性实验配制同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，24，36，48h后进样，求得甘草苷的RSD为1.44%，甘草酸的RSD为0.89%，说明样品溶液在48h内稳定。2.8回收率实验取含量的同一供试品溶液各5份，分别精细参加同一浓度同一体积的甘草苷对照品溶液，甘草酸单铵盐对照品溶液，混匀，进样，按上述方法测定甘草酸和甘草苷的含量，测得甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为101.4%，101.3%；RSD值分别为1.18%，1.22%。说明本实验所确定的HPL法进展甘草苷和甘草酸的含量分析，准

11、确度较高。结果见表1。表1甘草酸和甘草苷的回收率实验结果2.9样品测定分别精细称定甘草黄酮粗提物和纯化物各3份，适量，按“2.2.2项方法制备所需的供试品溶液，按“2.1项的色谱条件分别测定甘草苷和甘草酸的峰面积，计算甘草黄酮粗提物烘干样中甘草苷和甘草酸的纯度分别为3.68%和18.38%，甘草黄酮纯化物烘干样中甘草苷的纯度为17.29%，未检测到甘草酸。结果见表2。甘草黄酮纯化物别离的色谱图见图5。表2样品测定结果测定项甘草黄酮粗提物123平均值RSD甘草黄酮纯化物123平均值RSD甘草酸纯度18.2518.5118.3918.380.71-甘草苷纯度3.623.733.693.681.51

12、17.1617.3117.4017.290.70“-为未检测到3讨论3.1甘草苷流动相的选择考察了选用不同比例的乙腈-0.5%醋酸为流动相时对甘草苷的保存时间及别离度的影响。实验结果说明，以乙腈-0.5%醋酸1090为流动相时，保存时间短，但峰形较差，乙腈比例增大后峰形变得较锋利对称，响应值显著增大，别离度逐渐改善，保存时间先增大后缩短，当乙腈比例大于20%后，未检测到甘草苷，综合考虑，选用乙腈-0.5%醋酸2080为流动相，甘草苷的保存时间适中，别离效果好。3.2甘草酸流动相的选择本实验分别选用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2lL-1乙酸铵溶液-冰醋酸(67321)为流动相，实验结果说

13、明，甲醇-2%乙酸7327和甲醇-0.2lL-1乙酸铵溶液-冰乙酸(67321)为流动相时，别离效果均较好，但在流动相的稳定性和分析时间的合理性方面，后者更优越，因此选用甲醇-0.2lL-1乙酸铵溶液-冰醋酸(67321)为流动相。按本法分别对甘草苷和甘草酸进展高效液相色谱分析，具有回收率和线性相关系数良好，操作简便，快速，样品用量少，精细度和重复性好，自动化程度高等优点，适用于甘草黄酮粗提物及纯化物中甘草苷和甘草酸的质量控制，具有广泛的应用前景。【参考文献】1邢国秀，李楠，王童，等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展J.中国中药杂志，2022，28(7)：593.2从景香，高丽娟，林炳昌，等.甘草黄酮类化合物研究进展J.精细化工