B组柯萨奇病毒对心肌细胞感染模式的研究

1、B组柯萨奇病毒对心肌细胞感染形式的研究【摘要】目的观察B组柯萨奇病毒(xsakievirusB，VB)在原代心肌细胞中的感染特点，从而研究VB对心肌细胞的致病机制。方法原代培养Balb/乳鼠心肌细胞，并获得纯化的心肌细胞。使用B组柯萨奇病毒嗜心肌毒株3型(VB3)攻击原代心肌细胞，观察病毒感染心肌细胞后心肌细胞的细胞病变、超微构造和心肌酶的变化。结果成功原代培养了Balb/乳鼠心肌细胞。心肌细胞在病毒感染后，细胞病变(PE)不明显，与在HeLa等细胞中的典型PE不同。心肌细胞在VB3感染后保持细胞形态和博动超过2周时间。电镜显示心肌细胞构造正常，细胞器数量增加，在心肌细胞胞质中可见晶格样病毒颗

2、粒排列。培养细胞的上清液中心肌酶升高。结论VB在原代心肌细胞中表现为持续感染，VB在心肌细胞中的致病机制不同于HeLa细胞。【关键词】心肌细胞;B组柯萨奇病毒;Balb/乳鼠;原代细胞培养Abstrat:bjetiveTinvestigatetheharateristisfxsakievirusB(VB)npriarilyulturedyardialellsandtexplrethepathgenesisfardiyytes.ethdsardiyytesfrBalb/suklinguseereulturedinvitr,andpurifiedyardialellserebtained.Theu

3、lturedyardialellsereattakedithVB3,ayardialtrpixsakievirusBstrain.Theytpathieffet(PE)andultrastrutureftheVB3-infetedyardialellserebserved.Thevariatinsfyardialenzyesinthesupernantftheultureediueredeterined.ResultsTheardiyytesfrnenateBalb/ieeresuessfullyultured.NapparentPEuldbebservedintheulturedyardia

4、lellsfllingtheVB3attak,hihasdifferentfrthetypialPEintheinfetinsfHeLaells.Theardiyytesretainedintatrphlgyandpulsatinfrverteeksasftheinfetin.Theeletrniirspyshedthattheyardialellshadnralultrastruture,ithaninreaseinthenuberfrganellesandvisiblerystally-arrangedviralpartilesintheytplas.Thelevelfyardialenz

5、yesinthesupernatantftheinfetedyardialellsashigherthanthatfthentrlgrup.nlusinVBanpersistentlyinfetardiyytes.ThepathgenesisfVBnyardialellsdiffersfrthatinHeLaell.Keyrds:ardiyytes;xsakievirusB;sukingBalb/use;priaryellultureB组柯萨奇病毒(xsakievirusB，VB)是病毒性心肌炎和心肌病的主要病因，其敏感动物模型是Balb/乳鼠，假如要离体研究VB对心肌的致病性，必须原代培养B

6、alb/乳鼠心肌细胞1。VB感染细胞通常表现为急性杀细胞病变，例如，宫颈癌细胞HeLa细胞是VB致病机制研究中最常用的细胞平台，VB感染HeLa细胞后，在24h出现明显细胞病变(PE)，细胞变圆聚集，48h细胞死亡脱落;理论上，VB感染心肌细胞也应该表现为杀细胞效应。但是，分子流行病学研究证明，VB可以持续存在心肌组织中。Quigley等2观察23例临床和组织学表现为心肌炎的患者，其中12例在平均43个月中开展为扩张型心肌病(D)，随后4例死亡，2例心脏移植，1例痊愈，其余仍为D。本课题利用VB1核酸、嗜心肌毒株B组柯萨奇病毒3型(VB3)攻击原代培养的Balb/乳鼠心肌细胞，观察VB在心肌细

7、胞中的感染特点，从而说明VB在心肌细胞中的感染机制。1材料和方法1.1材料1.1.1病毒VB3由哈尔滨医科大学微生物学教研室惠赠。1.1.2质粒、细胞与实验动物pNI4质粒含VB1DNA全序列3，由日本东京大学NarushiIizuka教授惠赠;HeLa细胞和工程菌株E.liDH5均购自哈尔滨医科大学微生物学教研室;Balb/乳鼠(出生4天内)购自徐州医学院实验动物中心。1.1.3主要酶类及试剂盒质粒小量提取试剂盒5001及DNA小量胶回收试剂盒5211购自上海华舜生物工程公司。真核转染试剂Tfx-50为Prega公司产品。RNA提取试剂盒TRIzlReagent为Invitrgen公司产品。

8、TherSriptTRT-PR试剂为Invitrgen公司产品。限制性核酸内切酶ERV、laI、PstI、碱性磷酸酶IAP及iderangDNAladderarker均为Takara公司产品。1.1.4主要试剂DE/F12培养基(GIB公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料)，胰蛋白酶(GIB公司)，胶原酶(Siga公司)，兔抗小鼠肌动蛋白(atin)抗体(Santaruz公司)，羊抗兔IgG-TRIT(北京中杉金桥生物技术公司)，5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU，Siga公司)，其余试剂均为国产分析纯。1.1.5细胞培养液DE/F12，pH7.27.4，使用时参加15%胎牛血清，1%双抗。消

9、化液为0.2%胰蛋白酶和0.1%胶原酶混合液(11)。BrdU用去离子水配制，参加到15%DE/F12培养液中，终浓度为0.1l/L，可以抑制非心肌细胞的生长。1.1.650TAE电泳缓冲液Tris碱242g、冰乙酸57.1l、0.5l/LpH8.0的EDTA100l溶于终体积1000l去离子水中，使用时150倍稀释;10加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、30%甘油混匀后保存于4;10g/L溴化乙锭(EB)溶液：0.2gEB溶于20l去离子水中，混匀后4避光保存，使用时终浓度为0.5g/L;0.7%和1%琼脂糖凝胶：0.7%和1%琼脂糖分别溶于1TAE中。1.2方法1.2.1乳

10、鼠心肌的取材取出生14天内的Balb/乳鼠，75%乙醇消毒皮肤，无菌条件下从胸腔取出心脏，取出的心脏立即放入装有预热37的D-Hanks液的培养皿中，可见到心脏仍然保持搏动。1.2.2乳鼠心肌细胞的别离和培养取出的心脏在加有37的D-Hanks液的平皿中，洗12次，置于无血清无双抗的DE/F12中，并在其中把心脏剪成体积为13的小块;事先准备好2支离心管，第1支参加5l左右15%DE/F12培养液(含血清和双抗)，第2支空，其中第1支放入4冰箱中备用。将小块的心肌放入第2支空着的离心管中，并参加1.5l消化液，然后放入到事先准备好的37的水浴锅中消化，每次消化11in，弃上清(保持温度在37)

11、，重复3次;第4次参加消化液2l，消化20in，每隔5in摇匀，每隔10in吹吸，以加速心肌细胞的消化，20in后将消化液吸出，放入在4冰箱中的离心管中，重复3次。将搜集好的心肌细胞1500r/in离心7in，弃上清，用5l预热37的15%DE/F12培养液重悬;在无菌平皿中用滤网过滤细胞悬液以去除大块有形成分;将过滤好的细胞液搜集到培养瓶中，置于375%2孵箱中培养2h，吸出尚未贴壁的细胞悬液，转移到24孔培养板中，置于375%2孵箱中培养，48h后换液，以后每34天更换培养液1次。定期在倒置显微镜下观察细胞生长的情况并摄影记录。1.2.3心肌细胞的鉴定倒置显微镜下常规观察细胞的生长情况，并

12、可见心肌细胞的搏动;超微构造观察：培养的细胞用消化液消化后，1500r/in离心、搜集心肌细胞，戊二醛固定，送电镜中心，透射电镜观察并摄片。1.2.4pNI4质粒转染心肌细胞在转染前把心肌细胞的培养液换成无双抗培养液培养，留神肌细胞90%成层分布后开场转染，按照转染试剂盒的说明进展。每天倒置显微镜下观察心肌细胞的变化，并在转染后的第1、3、6天汲取心肌细胞的上清液冻存，测定心肌酶。1.2.5嗜心肌毒株VB3攻击心肌细胞培养的心肌细胞90%成层分布后进展病毒接种。方法如下：弃上清，每孔参加稀释好的病毒100l，375%2孵箱中孵育1h，参加细胞培养液至1l，375%2孵箱中培养。每天在倒置显微镜

13、下观察心肌细胞的变化，并在不同的时间段汲取细胞上清液，测定心肌酶谱和提取病毒RNA，最后用消化液消化、1500r/in离心、搜集心肌细胞，戊二醛固定，超薄切片，透射电镜观察心肌细胞的超微构造。2结果2.1心肌细胞形态观察倒置显微镜下，消化后的心肌细胞呈圆形，细胞数为4.8109/L，2h后开场贴壁生长，心肌细胞伸展为圆形、梭形、棒状、星状及分叉状等，12个呈圆形的胞核，核仁明晰可见，可见心肌细胞搏动，频率为2030次/in，搏动细胞达70%，搏动频率有所不同;24h后95%的细胞均有搏动，当生长成片后可见岛屿状搏动，搏动频率为80150次/in(图1A);超微构造观察显示，培养的心肌细胞肌丝兴

14、旺，游离的核糖体、糖原及线粒体丰富，肌节明显，粗肌丝与细肌丝相间排列形成明显的Z线。相邻心肌细胞之间伸出许多突起，由中间连接、桥粒及缝隙连接构成闰盘构造。线粒体多分布于核周或排列在肌丝之间，嵴呈板状，与线粒体长轴垂直或平行，密集排列。心肌细胞核为12个，椭圆形，核仁明晰，染色质分布均匀(图1B)。图1原代培养Balb/乳鼠心肌细胞形态观察A.倒置显微镜下观察(100);B.心肌细胞超微构造观察(20000)2.2心肌细胞成活率的测定取细胞悬液，稀释到109/L，用0.4%台盼蓝染色，未着色的为活细胞,呈蓝色的为死细胞,显微镜下观察并计算心肌细胞的成活率，计数200个细胞，11个染蓝色，成活率为

15、94.5%。2.3pNI4质粒转染心肌细胞后倒置显微镜观察结果质粒转染前的心肌细胞在倒置显微镜下可见：心肌细胞伸展为圆形、梭形、棒状、星状及分叉状等;胞核多为1个，间或多个，核呈圆形，核仁明晰;可见到自发性搏动，但节律不一，慢的1in仅数次，快的可达120次/in以上;细胞间形成细胞簇，可出现同簇细胞的同步搏动(图2A)。质粒转染后第3天，心肌细胞数量减少，心肌细胞主要为梭形和分叉状;胞核为12个，核呈圆形，但是核仁不明晰;仍然可以见到自发性搏动，但是节律不齐;可见到心肌细胞呈空泡样改变，很难看见成簇的心肌细胞(图2B)。图2pNI4转染前后的心肌细胞形态比拟(400)A.转染前;B.转染后2

16、.4VB3攻击后心肌细胞形态观察结果VB3病毒攻击后3天左右，倒置显微镜下可见成纤维细胞破裂崩解，细胞核固缩，飘浮在培养液中。心肌细胞没有出现明显的细胞病变(PE)，仍然搏动但是较慢、不规那么，心肌细胞仍然贴壁生长(图3);超微构造观察可见心肌细胞呈矩形，核位于质膜下，核周细胞器丰富，核膜增厚，细胞核形状可见畸变，核内染色质明显固缩，细胞膜和肌原纤维根本完好，但是线粒体膜局部破裂，线粒体嵴呈絮状改变或者肿胀而大小不一，胞质内可见到结晶状的病毒颗粒，呈黑色点状排列(图4)。图3VB3感染的心肌细胞形态学观察(100)转贴于论文联盟.ll.2.5pNI4质粒转染心肌细胞后心肌酶检测结果分别在转染前

17、(1、3天)和转染后(1、3、6天)汲取细胞上清液，冻存后使用日立7600型生化自动分析仪来测定心肌细胞酶。结果显示质粒转染后，病毒在心肌细胞中合成复制，导致心肌细胞局部破裂崩解，致使心肌酶都有不同程度的升高(表1);经过3天以后，心肌酶开场下降，有的降到了非常低的程度，此时的心肌细胞仍然存活并可见搏动。2.6VB3病毒攻击后心肌酶检测结果病毒接种后留1孔做空白对照，比拟加病毒后心肌酶的变化。结果可见，病毒感染心肌细胞后，虽然没有出现明显的细胞病变，但是在病毒感染的情况下心肌酶的释放会升高(表2)。表1pNI4质粒转染后心肌酶测定结果(2批心肌细胞测定后取平均值)表2病毒接种后心肌细胞酶测定(

18、2批心肌细胞测定后取平均值)2.7RT-PR扩增VB3病毒5-UTR的结果为了证明心肌细胞中有VB3存在，并且病毒处于持续感染状态，汲取质粒转染后和病毒感染后的心肌细胞的上清液，应用逆转录PR扩增病毒的5-UTR(asterylergradientPR)，结果如图5所示，扩增到特异性大小的目的片断，均为750bp。图5RT-PR扩增VB3病毒5-UTR1.VB3阳性对照;2.pNI4质粒转染后心肌细胞的上清液;3.VB3感染心肌细胞后的病毒上清液;4.阴性对照;.DL2000arker3讨论3.1心肌细胞的原代培养自1960年Harary首次对istar乳鼠的心肌细胞进展培养，并成功维持自发性

19、搏动长达40天以来，国内外诸多学者开展了离体心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面的研究。本实验的方法在前人方法的根底上加以改良，体外别离和培养Balb/乳鼠心肌细胞，并成功地获得了很高的成活率和纯度!培养24h后存活的心肌细胞即可贴壁生长，而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死，此时更换培养液可进一步进步心肌细胞的存活率;利用atin免疫荧光检测，证明我们获得的Balb/乳鼠原代心肌细胞纯度达95%;心肌细胞搏动说明具有自律性的心肌细胞活性和状态良好。通过反复实验我们发现：最好选择14天内的新生鼠进展原代心肌细胞培养，尤其是3天内培养更好;严格无菌操作，翻

20、开胸腔后迅速摘取跳动的心脏，操作要纯熟快捷;利用BrdU对成纤维细胞的抑制作用，以及差速贴壁等方法，可以极大地纯化心肌细胞;消化过程是影响心肌细胞存活率的重要因素，胰蛋白酶可分解组织间质的蛋白成分,但对肌细胞膜蛋白亦起较强的破坏作用4，故对其作用时间和浓度的要求较为严格。而每次实验都可能有细微差异，所以应结合肉眼观察消化情况及时终止消化，不宜固定准确的消化时间。胶原酶可消化细胞间质的胶原纤维以释放细胞，作用较缓和，对细胞损伤较小;经过屡次重复实验，我们认为单一使用胰蛋白酶消化对细胞损伤大，结合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀,进步心肌细胞存活率，细胞贴壁早，搏动出现亦早5。第1

21、次消化时间不宜过长，否那么会丢弃一些已消化下来的心肌细胞。终止消化后的消化产物应立即离心，而后用培养液重悬以使受损的细胞尽早恢复。消化过程中反复吹打使酶与组织充分均匀接触，使心肌细胞呈单个分散状态从而减少消化次数和时间，进步细胞存活率。吹打不充分细胞团块占5%以上会大大降低心肌细胞的收获率，并且从团块中爬出来的成纤维细胞影响心肌细胞的生长和纯度6。培养液是维持细胞生存的根本条件，心肌细胞在偏酸性环境中(pH值7.07.2)更利于生长，培养液储存后pH值逐渐升高，最好现配现用。抗生素的药效浓度与毒效浓度接近，对细胞可造成损害，实验中注意无菌操作可有效预防污染，故培养液尽量少加抗生素7。3.2VB

22、感染心肌细胞的形式VB感染HeLa细胞后会出现明显的细胞病变(PE)，在VB攻击24h72h内，被感染的HeLa细胞变圆、聚堆、固缩，最终漂浮在培养液中，肿胀死亡，表现为急性感染形式。但是嗜心肌的VB3攻击原代心肌细胞24h之后，那些梭形、分裂旺盛的成纤维细胞表现出变圆、聚集等细胞病变，并在48h后死亡脱落，而心肌细胞仍然贴壁生长，并保持博动，相比未感染病毒的心肌细胞，感染VB3的心肌细胞的搏动稍慢且不规那么，个别细胞在病毒感染后保持博动长达10天以上。透射电镜观察可见，被感染的心肌细胞超微构造根本完好，线粒体变化明显，线粒体膜局部破裂，线粒体嵴呈絮状改变或者肿胀而大小不一，胞质内可见到晶格状的病毒颗粒，呈黑色点状排列。RT-PR可从感染VB3的心肌细胞扩增到VB35-UTR。这些结果证实心肌细胞已经被VB3感染，但被感染的心肌细胞没有表现出类似HeLa细胞的急性细胞病变效应。pNI4含有VB1全长DNA，转染HeLa细胞后可以转录出VB1全长RNA基因组，并在细胞中复制增殖出大量完好VB1病毒，我们将pNI4转染原代培养心肌细胞，结果虽然可以通过RT-PR检测到VB15-UTR，却不能看到细胞病变类似VB3攻击HeLa细胞的表现。检测感染或转染的心肌细胞培养液，可见心肌酶的程度和对照细胞相比有变化，说明VB感染