基于表面增强拉曼技术的DNA循环放大生物传感方法的研究

1、PAGE 分类号： 学校代码： 10426 密级： 学号： 2011050205 硕 士 学 位 论 文MASTER DEGREE THESIS基于表面增强拉曼技术的DNA循环放大生物传感方法的研究作 者： 郭园园 指导教师： 张书圣 学科专业： 分 析 化 学 专业代码： 070302 研究方向： 生物化学分析 2014 年 4 月 10 日 I 基于表面增强拉曼技术的DNA循环放大生物传感方法的研究摘 要 本文主要做了以下几个方面的工作：一是基于表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman scattering spectrum, SERS）检测技术构建了一种新型的DNA

2、循环放大方法，利用DNA酶和目标分子结合后独特的共反应催化剪切活性，实现了高灵敏度检测小分子物质L-组氨酸的方法。二是将纳米金粒子上分别修饰Rox分子和Cy3分子，制备了具有SERS活性的两种纳米金生物条码，基于表面增强拉曼散射分析方法，结合靶DNA引发的链替代循环反应，实现了两种目标DNA的同时检测。在此基础上，引入双功能适体探针，实现了ATP和L-组氨酸的同时检测。具体介绍如下： 1. 利用DNA酶替代了传统检测方法中的目标分子识别适体，基于DNA酶与目标分子结合而引发的共反应催化剪切活性释放引发链，进而激发链替代循环反应，结合发卡探针引发的循环放大方法，实现了小分子物质L-组氨酸的高灵敏

3、度检测，检测限达0.74 nM (3)。利用引发链的再循环利用，固定在磁珠上的发卡探针被不断的打开，进而大量的生物条码被固定到了磁珠上，实现了高效的源头信号放大，并通过磁性分离和洗涤，除去过量的纳米金生物条码，降低了检测体系的背景值，从而实现了L-组氨酸的高灵敏度检测，可用于实际样品细胞匀浆中的L-组氨酸的测定。该方法设计较为简单，操作快捷方便，更有广泛的适用性和良好的选择性。2. 利用表面增强拉曼散射技术高分辨率的特性，基于DNA链之间的碱基互补原理，创建了一种新型的电化学检测方法，实现了两种目标DNA的同时检测。以纳米金为增强底物，制备了分别由Rox分子、Cy3分子修饰的两种不同的生物条码

4、探针。在目标DNA存在下，发生引物链增长-替代反应，实现了源头信号放大，使信号显著增强，检测灵敏度显著提高。3. 构建了一种新型的DNA双功能适体链，结合DNA循环放大反应，提出了一种利用表面增强拉曼技术同时检测ATP与L-组氨酸的方法。在金纳米粒子上分别修饰上Rox分子与Cy3分子，得到两种不同的生物条码。利用DNA双功能适体链与两种目标分析物的特异性结合，释放出两条引物链，激发对应发卡探针的循环放大反应，大量的生物条码被固定到磁珠上。最终通过检测固定到磁珠上的生物条码，实现了两种目标分析物质ATP与L-组氨酸的高灵敏度检测。关键词：适体DNA 表面增强拉曼光谱 纳米金生物条码 循环放大 I

5、I II BIOSENSING METHOD RESEARCH WITH DNA-RELATED CYCLES AMPLIFICATION USING SERS DETECTION TECHNOLOGYABSTRACTIn this study, a series of SERS signal amplification biosensing methods were developed with high sensitivity, easy operation and good reproducibility. First, a novel SERS method was designed

6、to detect L-histidine based on DNA amplification technique. The DNAzyme as a molecular recognition module will trigger circular hairpin assisted exponential amplification reaction simultaneously. Second, two kinds of differently modified bio-barcodes were prepared to detect the corresponding two kin

7、ds of genes based on autonomous target-displacement polymerization reaction. On this basis, a difunctional aptamer probe was introduced into the system to detect ATP and lysozyme simultaneously. These SERS biosensing method provides a universal method for quantitative analysis of genes, cells and al

8、so proteins, etc, and supplies valuable information for biomedical research.1. A novel SERS method based on DNAzyme which can specifically recognize L-histidine is demonstrated in this assay to detect L-histidine. It was confirmed that the unmodied DNAzyme had characteristic of endonuclease as long

9、as it combined with the target. In the DNA recycling amplification reaction, a large number of bio-barcodes were indirectly captured on the magnetic beads as the hairpin probes immobilized on the magnetic beads were constantly opened. The problem of high background induced by excess bio-barcodes was

10、 solved by magnetic separation. The detection limit of 0.74 nM (3) was gained with the amplification of hairpin assisted exponential amplification reaction. Due to its high sensitivity, excellent specificity and good performance in cellular homogenate, it holds great potential for the development of

11、 ultrasensitive biosensing platform for the applications in bioanalysis. III 2. A sensitive SERS detection method was developed based on hairpin assisted exponential amplification reaction and used to detect two target DNA simultaneously. The amplification process is accomplished by taking advantage

12、 of both two kinds of hairpin assisted exponential amplification reaction. Two different kinds of bio-barcodes which are modified with Rox and Cy3 respectively were prepared while gold nanoparticles works as the enhanced substrate. The rapid and sensitive analysis of target DNA demonstrated the appl

13、ealing bioanalytical features of this method.3. On the basis of the above work, we proposed a new method for detection of ATP and L-histidine simultaneously. A novel difunctional aptamer which can both recognize ATP and L-histidine was first introduced into ultrasensitive SERS biosensing application

14、s based on the DNA amplification method. Compared with the second experiment, two kinds of trigger genes were immobilized on the magnetic beads earlier and then released by the recognition of ATP and L-histidine. The two cycles which were independent and happen simultaneously as an effective amplifi

15、ed replication system were triggered. A large number of biobarcodes were immobilized on the magnetic beads indirectly. With multiple amplification steps and magnetic separation procedures, this new biosensing system exhibits high sensitivity and specificity.KEY WORDS: Aptamer DNA SERS Nano Au biobar

16、code Amplification VIII IV 目录TOC o 1-4 h u HYPERLINK l _Toc10828 第一章 前 言 XII VI HYPERLINK l _Toc11251 2.4.2 Cy3修饰的纳米金生物条码的制备55 HYPERLINK l _Toc21925 2.5 双适体DNA修饰的MB的制备55 HYPERLINK l _Toc23115 2.6 两种发卡探针DNA修饰的MB的制备56 HYPERLINK l _Toc20119 2.7 循环放大反应56 HYPERLINK l _Toc5288 2.8 SERS检测ATP与L-组氨酸56 HYPERL

17、INK l _Toc7306 3 结果与讨论57 HYPERLINK l _Toc28118 3.1 基于双功能适体SERS传感方法同时检测ATP和L-组氨酸的工作原理57 HYPERLINK l _Toc6534 3.2 可行性实验58 HYPERLINK l _Toc26729 3.3 实验条件的优化59 HYPERLINK l _Toc13273 3.3.1缓冲溶液pH的优化59 HYPERLINK l _Toc24434 3.3.2实验温度的优化60 HYPERLINK l _Toc20572 3.3.3 Klenow聚合酶用量的优化60 HYPERLINK l _Toc2603 3.

18、3.4 循环反应时间的优化 PAGEREF _Toc2603 61 HYPERLINK l _Toc16392 3.4 基于双功能适体同时检测SERS传感方法的检测灵敏度 PAGEREF _Toc16392 62 HYPERLINK l _Toc6602 3.5 双功能适体在实际样品中的检测64 HYPERLINK l _Toc6602 4 小结65 HYPERLINK l _Toc27366 参考文献66 HYPERLINK l _Toc11030 结 论68 HYPERLINK l _Toc9195 致 谢69 HYPERLINK l _Toc20851 攻读学位期间发表的学术论文目录70

19、 HYPERLINK l _Toc29752 独 创 性 声 明 第一章 前 言1生物传感方法生物传感方法自诞生半个世纪以来得到了迅速的发展，同时其在食品安全监测、临床检测、新药的研发等领域具有广阔的研究潜力和应用前景。生物传感方法并不是独立存在的一项科学技术，它与很多学科密切相关，是现代先进生物技术与化学、物理学、环境科学、生命科学、材料科学等诸多学科相互融合共同组成的，且在很多科研领域有着不可替代的作用。近些年来，化学、材料科学、环境科学、生物信息学的迅猛发展为生物分析方法的不断拓展奠定了坚实的基础，对相关物质的分析不再满足于“是什么物质”和“含量有多少”这两个简单的问题，这就对分析技术的

20、精度提出了更高的要求。生物传感分析方法具有灵敏度高、特异性强等优点，且分析前对样品只需简单处理，操作简单易行，响应迅速，检测时间短，检测结果可靠且可信。1.1 生物传感方法的检测原理生物传感分析方法的工作依赖于待测物质与其识别物质的结合，因此我们在设计一种生物传感分析方法的时候，最重要的工作就是设计一种合适的对应于待测物质的分子识别适体，组织、酶、抗体、细胞、核酸等，都是生物体生命活动中进行特异性的选择辨别的物质基础。这些物质通过与待测目标物质发生特异性识别过程相结合，进而两者形成一种复合物，例如基质与酶的结合、适体与目标分子的结合、生物抗原和抗体的结合等。信号转换装置的选择也是研发高精确度、

21、高灵敏度的优质生物传感器的关键环节，通常我们依据敏感元件所引发的化学变化或者物理变化来选择生物传感体系的信号转换部分。敏感元件化学反应过程中相关物质的生成及消耗、光以及热都会随着反应的进行产生一系列的变化，依据这些变化，我们可以去选择合适的适宜于实验体系的信号转换装置。由于生物的化学反应非常复杂，因此其所产生的生物化学信号也是多种多样且极难追踪检测，现代生物传感技术的研究变得尤为重要，近些年其研究成果为检测生物化学信息提供了极为丰富的手段。1.2生物传感方法的分类目前，已经研究出很多种生物传感分析方法，根据分类标准不同，可以分成不同的类别：例如根据功能分子材料的的不同分类有：DNA生物传感分析

22、方法、酶生物传感方法、微生物传感方法、活体组织传感方法、细胞生物传感方法、免疫传感方法等。 1.2.1 酶生物传感方法酶传感方法是最早发展和研究的一类生物传感分析方法，因此酶传感分析技术也相对比较成熟1-6。它的工作原理是通过酶的催化作用，结合换能装置记录生物分子发生化学反应引起的变化，进而得到待测物质的实际浓度等信息。目前所研制的生物葡萄糖传感分析方法已经用到临床分析中。它的工作原理是将生物酶电极插到待测溶液中，溶液中所含的葡萄糖会扩散到酶电极的表面上，进而葡萄糖发生化学反应，在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸，同时反应消耗了一定量的氧气，最后通过氧电极来测定溶液中所含氧气浓度的变化，

23、从而计算出样品中所含葡萄糖的浓度。1.2.2免疫传感分析方法免疫传感分析方法的基本工作原理：免疫传感分析方法是利用抗原与抗体的特异性结合效应，先使酶与待测样品相连接，之后酶与反应底物发生化学反应，进而达到定量测定目标物质的目的。免疫传感分析方法在生物免疫研究领域有着广泛的应用7-11。使用免疫传感方法这种测定技术大体主要需要三种试剂：酶作用底物、标记物（酶标记抗原或者抗体）、免疫吸附剂（固相抗原或者抗体）。免疫传感分析方法主要有三种构成方法：双抗体夹心法、间接法、竞争法。1.2.3 细胞传感方法细胞传感方法因以动植物活细胞为探测单元，故由此得名。细胞传感方法敏感性高，故其应用范围很广12-15

24、，特别是在癌症的早期诊断上：利用三乙酸纤维素膜把人类脐静脉内皮细胞固定于离子选择性电极上，可以达到一个很好的肿瘤细胞传感检测器的作用。此时，肿瘤细胞所释放的VEGF会刺激细胞，同时，离子选择性电极的电位也会随之发生相应的变化，由此可以用来诊断早期癌症。1.2.4 DNA生物传感分析方法 DNA生物传感分析方法是以DNA为分子识别元件的生物传感方法，由于其依据DNA分子之间的相互作用或者DNA分子与其他相应物质的反应，因此对于分子水平的检测具有超灵敏的效应。将检测探针设计为与被测目标分子特异性识别或者与目标DNA分子对应碱基互补的单链DNA分子，即可实现对探针与目标物之间反应的跟踪分析，最终可完

25、成对目标物的分析检测。DNA生物传感分析方法检测快速便捷、灵敏度高、稳定性强、可重复操作，逐渐成为当今生物分析检测领域的研究热点。2 DNA生物传感方法简介2.1 DNA简介由大量核苷酸聚合而成的生物大分子化合物叫做核酸，核酸是生物体正常生命活动的基本物质之一，其在生物体内，常被用做携带遗传信息，核酸广泛存在于动物细胞、植物细胞以及微生物细胞体内。根据核苷酸排列顺序的不同，可以分为不同的核酸。而根据其化学组成的不同，核酸又分为脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid， 简称DNA）与核糖核酸（Ribonucleic acid，简称 RNA）和。DNA在遗传信息的贮存、传递以及复

26、制过程中起着重要的作用，是生物代代遗传的主要物质基础。而RNA也具有传递遗传信息的作用，其主要通过自发组装或者在生物体内自复制来表达或传递遗传信息，除此之外，RNA还在蛋白质的合成过程中起着至关重要的作用。2.2 DNA组成和结构 DNA是一种长链聚合物，它的相对分子质量非常大，大体在几十万甚至几百万，而构成DNA的基本单元主要有三种，分别为脱氧核糖、核苷酸碱基和磷酸。DNA的长链骨架由脱氧核糖（即五碳糖）与磷酸分子之间以酯键相连构成，排列在外侧，而构成DNA的四种碱基则排列在内侧。碱基与五碳糖分子一一相连，根据遗传密码可指导合成HYPERLINK /view/15472.htm蛋白质。 核苷

27、酸碱基分为四种，两种嘌呤分别是鸟嘌呤（guanine G）和腺嘌呤（adenine A），两种嘧啶分别是胞嘧啶（cytosine C）和胸腺嘧啶（thymine T）。生物之所以能够分成不同物种，归根结底是因为DNA的碱基组成有所不同，但是总体仍然遵循一定的规则，即HYPERLINK /view/62922.htm腺嘌呤总数必等于其HYPERLINK /view/476385.htm胸腺嘧啶总数（A=T），而HYPERLINK /view/125105.htm鸟嘌呤总数也必然等于胞嘧啶总数（G=C），因而HYPERLINK /view/1006.htm嘌呤总数之和必等于嘧啶总数之和。DNA从结

28、构方面来讲，一般可以划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DNA分子的一级结构是指DNA分子结构中核苷酸的排列顺序，即核苷酸之间通过3，5-磷酸二酯键连接且没有支链的环状的或者直线形结构；二级结构则是指是指由两条脱氧核苷酸链以反向平行扭曲盘绕得形式最终而形成的双螺旋结构；DNA的三级结构是指DNA在二级结构的基础之上进一步扭曲盘绕所形成的特定的空间结构，也称之为超螺旋结构；DNA的四级结构则是指HYPERLINK /view/28220.htm核酸以反式作用存在（例如核糖体、剪接体）。 HYPERLINK /v6624473.htm?ch=ch.bk.innerlinkDNA分

29、子结构中，由于碱基之间的HYPERLINK /v215102.htm?ch=ch.bk.innerlink氢键具有固定的数目，并且HYPERLINK /v118459.htm?ch=ch.bk.innerlinkDNA两条链之间的距离也保持固定不变，因此碱基配对需遵循一定的规律，不同碱基之间的这种一一对应的规律叫做碱基互补配对原则，即Adenine（A，HYPERLINK /v277302.htm?ch=ch.bk.innerlink腺嘌呤）一定会与Thymine（T，HYPERLINK /v277235.htm?ch=ch.bk.innerlink胸腺嘧啶）配对，Guanine（G，HYPE

30、RLINK /v277227.htm?ch=ch.bk.innerlink鸟嘌呤）一定会与Cytosine（C，HYPERLINK /v277221.htm?ch=ch.bk.innerlink胞嘧啶）配对，反之亦然。 图1-1 DNA分子双螺旋结构模型Fig. 1-1 The structure of DNA double helix构成DNA链的通过碱基间配对连接的长链，称为互补链（complementary chain）。两条互补链呈现出反向平行的螺旋结构，每一螺距长度为3.4 nm，内包括10个碱基对。虽然使碱基间配对连接的氢键作用力非常弱，但是由于互补链之间存在着大量的碱基对，所以在

31、自然生理条件下两条链不会自发地分开。但是，如果将其置于高温下，DNA分子内的氢键将会遭到破坏，于是双螺旋结构解离成两条互补单链。这一过程称为高温变性（denaturation）。如果将变性后的两条互补链再置于正常温度条件下，他们又会重新自发连接形成双螺旋结构。这一过程又称作复性（renaturation）。由于A-T之间存在两个氢键，而G-C之间存在三个氢键，所以就变性和复性而言，G-C所需能量比A-T高。大部分DNA自然状态下以双螺旋结构存在，但一经热处理或碱处理就会变性为单链状态。2.3 DNA酶简介根据其功能的不同，可将DNA酶分为不同类别：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA限制性内切酶

32、、DNA修饰酶、DNA解旋酶等。随着人类基因组计划的启动，各种不同类别的DNA酶也得到了广泛的应用和研究。在DNA片段分析、重组DNA技术、基因诊断、现代医学临床实验中，DNA酶起到了非常重要的作用。在DNA复制过程中，以一条单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链，形成链与母链构成一个DNA分子。限制性核酸内切酶主要存在于微生物如细菌、霉菌等中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。其最早发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。2.4 核酸适体简介近些年来经科

33、学研究发现，DNA和RNA除了起到遗传信息传递与存储的作用外，还有许多其他的非常重要的作用，例如经过SELEX体外筛选技术（指数富集配体系统进化）而筛选出的寡聚核苷酸片段，具有能特异结合细胞、蛋白质大分子或其他小分子物质的功能，这就是核酸适体。核酸适体能够借助自身所形成的特异性的空间结构与其它类型的靶分子相互作用，而利用寡核苷酸间的严格的识别能力与高度的亲和力成功制备了人工合成寡核苷酸适体（aptamer），这种人工合成核酸适体的出现，使抗体抗原特异性反应发生了新的革命性的变化，弥补了现有自然存在抗体的不足，也为生物传感器的长远发展开辟了一条崭新的道路。核酸适体（aptamer）是由大约25-

34、80个碱基组成的寡聚核苷酸片段，能与蛋白质、细胞、生物活性小分子等靶物质特异性结合，对靶物质具有高度的亲和性与特异性的识别能力，既可以是DNA单链也可以是RNA单链16,17。而结合核酸适体所提出的生物传感分析方法则是利用核酸适体与靶物质之间的特异性识别能力进行相关靶物质的检测的生化分析方法。核酸适体是一种作用类似于抗体的核酸单链分子。通过SELEX技术（即指数富集配体系统进化技术）可以从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来具有一定功能的核酸适体。首先可以利用SELEX技术从核酸文库中筛选得到寡核苷酸片段，再将寡核苷酸片段进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reactio

35、n，PCR）进行扩增，最后将其排列成一个特定的识别单元18-20。1990 年，Tuerk课题组21首先利用SELEX 筛选技术得到了特异性识别噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA适体，自此之后这项筛选技术就成为了各国科研学者的研究热点，进而为化学、生物以及医学领域的研究不断提供大量的特异性核酸适体，增加了检测手段，提高了待检物质的范围，同时也大大提高了检测限和检测效率。利用SELEX 技术从库容量为1015 左右的随机的寡核苷酸序列库中筛选到与待测靶分子能够特异性识别的一系列核苷酸序列，然后继续将这一序列通过数轮的筛选、分离与扩增，最终得到与靶物质结合能力最强的DNA单链或RNA单链。核酸适体主

36、要具有以下几个方面的特点：（1）严格的识别能力与高度的亲和力：寡聚单链DNA或者RNA可以形成多种具有热力学稳定性的三维空间结构，因此它与靶分子有高度的亲和力。相比于其它种类的配体，核酸适体对目标物质的亲和力解离常数约在10-12 M 10-9 M范围之间22,23，并且有些适体的结合能力甚至超出了其天然配体。例如角质细胞生长因子与其对应的核酸适体结合的解离常数竟高达300 fM，是迄今为止发现的亲和力最高的适配体对24。（2）目标物质范围广：适体所结合的靶分子不仅仅限于蛋白质和核酸，还同样适用于生长因子、酶、基因调节因子、植物凝集素、抗体、完整的病毒颗粒以及病原菌等。同时适体也可以用作小分子

37、量目标分子的检测，包括辅因子、药物、金属离子、氨基酸、氨基糖苷、以及抗生素等。（3）人工合成、便于修饰。经过筛选后的核酸片段可以通过人工合成路径得到，不依赖于细胞或者动物，所需费用低。可根据其用途在特定的位置修饰上标记物或者官能团且不影响核酸适体本来的生物活性，例如生物素标记、荧光标记、酶标记、放射性标记，从而实现核酸适体分子由单功能向多功能的转化。（4）用于诊断性实验的广泛性：适体与靶分子之间的的特异性结合类似于抗原抗体特异性识别所形成的复合物，其结合信号能通过多种方式表现出来，因此可以应用分子信标、流式细胞技术、荧光偏振、传感器以及毛细管电泳等多种检测手段，其应用的普遍性远远超过抗体。（5

38、）稳定性好：核酸适体具有良好的稳定性，可以反复变性、复性而不损伤其生物活性。因此将核酸适体冻成干粉后可以保存数年，取出后适当溶解又可以立刻恢复其生物功能，因此核酸适体与抗体相比具有很多优势。近几年来，核酸适体生物传感器的研究得到了迅猛的发展，在新型核酸适体传感器的设计方面、其分析特征例如灵敏度、稳定性以及线性范围的改善方面，以及其应用范围的拓展等研究领域均取得了显著的成果25。3 表面增强拉曼散射光谱3.1 拉曼散射光谱简介3.1.1 拉曼散射光谱简介1928年，印度物理学家拉曼（ChandrasekharaV.Raman）在研究苯的光散射时，发现当光透过透明介质时，被散射的光频率发生了变化，

39、这一现象称为拉曼散射现象，即在散射光中不仅包括频率与入射光相同的谱线，而且还包括频率不同于入射光且强度极其微弱的谱线。人们将这一光谱以发现者拉曼的名字命名，称为拉曼散射光，与之对应的这种光现象称作拉曼效应26,27。1930年，拉曼先生因这一发现获得诺贝尔物理学奖。1960年，激光的出现，致使拉曼光谱这一分子振动光谱技术得到了前所未有的飞速发展，进而逐渐成为研究各类物质的微观结构以及分子结构的重要手段，从而得到了化学家、物理学家以及生物学家等的广泛关注。光散射是自然界中普遍存在的现象。波数为0的单色光照到分子时，会和其中的电子发生强烈的相互作用，致使分子极化，因此产生了散射光。当作为散射中心的

40、分子与激发光的光子相互作用时，可能发生两种情况，即弹性碰撞与非弹性碰撞。如果发生弹性碰撞，光子与分子之间不存在能量交换现象，这时的散射光仅改变反射方向，不改变光的频率，这种光散射过程被称为瑞利散射，瑞利散射是一种弹性散射。而另外的少数入射光发生非弹性碰撞，过程中产生的散射光大约占总散射光的10-610-8，这部分光子与分子之间会发生能量交换，光量子会或者转移一部分能量给散射分子，或者从散射分子束中吸收一部分能量，因此最终这部分光不仅改变了传播方向，也改变了频率。这种频率发生变化的散射称为拉曼（Raman）效应，拉曼散射是一种非弹性散射28。 如图1-2所示，在入射光照射下，分子由基态（或振动激

41、发态E1）被激发，跃迁到一个受激虚态（virtual state），该状态是介于基态与电子第一激发态之间的一个态势，之后发出光子，分子又跃迁重新回到振动激发态E1（或基态E0），这个过程对应于弹性碰撞，光子得到或失去的能量与分子得到或失去的能量相等，这种散射线即叫做瑞利散射线。化学键或基团不同，其振动能级也会不同，E代表指定能级的相应变化。与其相对应的光子的频率变化也是特异性的，根据对应光子频率的变化的不同可以判断出分子所包含的化学键的类别或基团的类别。不同的物质有自己的特征拉曼光谱，因此拉曼光谱可以用于物质的定性或者表征。拉曼谱线会成对出现且其谱线宽度一般比较窄，短于入射光波长（0+）一边的

42、谱线定义为反斯托克斯（anti-Stokes）线，长波长（0-）一边的定义为斯托克斯线（Stokes）。斯托克斯线（Stokes）和反斯托克斯线（Anti-stokes）在常态下同时存在，且分为高能态与低能态，但是由于分子总能量遵守Boltzmann定律，因此处于低能态的分子总数总是比处于高能态上的分子总数多，所以通常斯托克斯线强度会比反斯托克斯线要强很多29。图1-2 能级示意图Figure 1-2 the schematic diagram of energy level model3.1.2拉曼散射的特点与红外吸收光谱类似，从拉曼光谱中，我们也可以得到关于分子振动或者转动的信息，但这两种

43、光谱在原理上却有很大的差别。拉曼光谱是一种散射光谱，而红外光谱则是一种吸收光谱；拉曼散射的产生原理是由于分子振动时极化率会发生变化，而红外光谱的产生原理却是由于分子振动时偶极矩发生变化；拉曼光谱与红外光谱实际中经常互补，测试具有对称中心的分子，如果得到的拉曼散射是非活性的，则其红外吸收光谱往往是活性的；反之，如果拉曼散射是活性的，则红外吸收光谱往往呈现非活性。对于很多特殊基团，常常同时具有红外活性与拉曼活性。目前拉曼光谱分析技术已经得到了广泛的应用，对于物质的鉴定、分子结构的研究，拉曼光谱提供了一种有效的鉴定手段。拉曼散射光谱具有以下特点：（1）虽然拉曼散射光谱的波数会随着入射光波数的不同而变

44、化，但是对于同一样品，同一拉曼谱线的位移则只与样品的振动转动能级有关，而与入射光的波长无关；（2）如果以波数为变量制作拉曼光谱图，则斯托克斯线和反斯托克斯线会对称地分布于瑞利散射线的两侧。（3）一般情况下，斯托克斯线的强度会比反斯托克斯线的强度大。这是由于Boltzmann分布定律，处于振动基态上的粒子总数远远多于处于振动激发态上的粒子总数。拉曼光谱技术具有很多优点：（1）拉曼光谱检测技术快速、操作过程简单且可重复操作、对样品无损伤、所需样品量微，可对痕量样品进行定性和定量分析，拉曼光谱分析无需样品准备，可将样品直接通过光纤探头测量或者通过光纤、玻璃和石英测量。（2）由于水的拉曼散射线强度微弱

45、，因此拉曼光谱是研究溶解于水中的生物样品或者化合物的理想工具。（3）拉曼光谱可以一次同时覆盖50-4000波数，操作时只需根据需要设置相应波数区间即可，可对无机物及有机物进行分析。相反，红外光谱若想一次同时覆盖相同的区间，则必须通过改变滤波器、光栅、检测器和光束分离器，操作过程相对繁琐。（4）拉曼光谱谱峰形状尖锐清晰，更适合用于数据库搜索、定量研究以及根据特征谱图进行定性研究。（5）因为激光束的直径非常微小，其在自身聚焦部位通常只有0.2-2毫米大小，因此只需少量的样品就可以得到其特征拉曼光谱。而且，结合拉曼显微镜物镜，可将激光束进一步进行聚焦最终达到1-20微米的程度，可分析面积微小的样品。

46、3.2表面增强拉曼散射技术3.2.1表面增强拉曼散射简介拉曼光谱能够提供测试分子的结构化学键或者基团的信息，并且测试结果不受水溶剂的影响，还可以根据不同的样品选择不同波长的激发光。但是拉曼光谱也存在一些局限性，例如其测试灵敏度低、空间分辨率易受衍射极限的限制等。并且在散射光中，拉曼光谱的光强大约仅仅是入射光强度的10-610-9。因此普通拉曼光谱的信号强度非常低，而且激光激发分子在产生拉曼散射信号的同时，常常也会伴有荧光信号的产生，因此拉曼信号很容易被荧光信号所掩盖，在实际操作中难以得到理想的拉曼散射光谱图像，所以拉曼信号的灵敏度太小，远远不能满足研究分子的结构和性质的需求。综合以上原因，拉曼

47、光谱在最初被发现以后，应用范围很窄，在表面科学中的应用极少，起初仅仅被用作红外光谱的补充，用以鉴别部分有机化合物的结构、构象以及官能团。之后，随着表面增强拉曼光谱技术的出现，上述研究中拉曼光谱的局限被逐一克服，拉曼光谱在表面科学中的应用飞速发展起来。由于具有拉曼效应的体系易受多方面因素的影响且组成一般比较复杂，因此SERS理论发展也一直比较迟缓。各国科研人员虽从各种角度对表面增强拉曼光谱效应做出解释，但截至目前为止，学术界对表面增强拉曼光谱效应的增强机理的解释仍未达成共识30。但是目前就总的来说，能够被人们广泛接受的SERS增强机理主要有两种，即电磁场增强和化学增强31，将这两种机理结合能很好

48、的解释拉曼光谱效应的增强原理。依据电磁场增强机制说，纳米粒子附近电场的强度被大大增强32。而依据化学增强机制说，由于纳米粒子与分子之间相互作用，导致分子电子态产生了变化，进而导致分子激发，亦或是纳米粒子与分子电荷相互转移的共振增强33。学者们一般认为 SERS 增强效应中电磁场对其贡献较多，而化学增强贡献较少。正是由于这一原因，电磁场增强学说在 SERS 研究领域中备受关注。 表面增强拉曼光谱作为一种分析检测手段，具有相对于其他分析方法的明显优势，主要可总结为以下三个方面： （1）灵敏度高：表面增强拉曼光谱其增强因子最高可达10141015，因此结合SERS可进行单分子检测，并且和其他分析方法

49、相比，其检测灵敏度丝毫不逊色。 （2）选择性高：因可在待测样品表面直接选择测试点，结合光谱共振增强的特性，表面增强拉曼光谱可在极其复杂的体系中选择性地仅增强目标分子或分子基团，使最终得到的光谱信息明了简单。 （3）检测条件温和：由于溶剂水对SERS基本无影响，因此SERS能够直接用于检测水溶液体系，而且样品的状态不受限制，可以是固态、液态甚至是汽态。SERS在生化分析研究领域应用的诸多独特优点34,35，现概括如下：1、SERS作为一种振动光谱技术，具有非常快的光谱采集速度。2、将SERS的分析物质修饰或者固着在在贵金属的表面，可以达到猝灭背景荧光的作用。3、拉曼与红外互补作用：因SERS具有

50、严格的特异性，所以一些低频振动峰若超出红外吸收范围，在一定条件下可以被SERS观测到，因此在分析领域可将红外与SERS结合使用。4、SERS是一种近场效应，只有当接近或者直接位于表面的分子才可以被检测到，由于这一性质，SERS成为生物分子间相互作用研究、痕量分析以及表面研究等的有力工具。5、由于水分子的SERS效应很弱，因此可以将SERS很好的应用于实际生物环境中。6、SERS的半峰宽较窄，分辨率很高，因此可以用于多元分析。 1974年，Fleisschman等人通过将光滑的银电极表面进行粗糙化处理，首次获得了高信噪比的吡啶分子的拉曼光谱，之后通过对这一现象进行分析，得出由于经过粗糙化处理的电

51、极表面面积大大增加，使电极表面附着了更多的吡啶分子，因此最终得到的拉曼信号强度大大增强，这一猜想并没有把信号增强的原因归于电极粗糙表面本身，但却为表面拉曼增强光谱的发展奠定了良好的基础。 1977年， Van Duyne和Creighton等人重复了Fleisschman的实验操作，发现如果将吡啶分子吸附在粗糙银电极表面，那么所得到的单个吡啶分子的拉曼信号要比在溶液中的单个吡啶分子的拉曼信号强大约106倍。1979年，Creighton等人将吡啶分子置于银溶胶和金溶胶中进行研究，最后也观测到了拉曼散射信号增强的现象。之后的许多研究都证实，当待测分子被吸附到金、银或者铜的粗糙化表面时，拉曼信号都

52、会被显著地增强。1997年，Nie小组36利用氩离子激光器结合表面增强拉曼光谱进行研究，采用514.5 nm激发光，将罗丹明6G染料分子吸附于单个的银纳米颗粒上的表面上，最终得到了其增强共振拉曼光谱图（SERS），经计算发现罗丹明分子的增强因子高达1014-1015。以上一系列重要的研究进展大大促进了SERS在生化分析中的应用。由于表面增强拉曼散射技术具有高灵敏度和高选择性的优点，其在食品检测领域也得到了广泛的应用。Theodore P. Labuza小组37利用适体的特异性结合表面增强拉曼散射技术用于食品中蓖麻毒蛋白的检测。如图1-3所示，将适体探针固定在银枝晶体结构上，通过目标分析物质蓖麻

53、毒蛋白与适体结合前后拉曼信号的变化来测定目标分析物的含量。体系中适体探针的使用简化了操作流程，提高了分析灵敏度，在PBS中检测限低达10 ngmL-1，在实际样品橙汁中检测限达50ngmL-1。图1-3 SERS适体传感器检测蓖麻毒蛋白原理示意图Figure 1-3 Schematic illustration of the SERS aptamer-based biosensor for ricin detection樊春海38等人将纳米滚环复制放大方法与表面增强拉曼散射结合，用于蛋白质微阵列的检测之中。如图1-6所示，实验中，将蛋白质和单链DNA同时固定到金纳米粒子基底上，单链DNA作为引

54、物生长出DNA长链，因此大量的SERS活性探针被固载到纳米基底上，使之继续参与到生物分子的识别检测中。如图1-4所示，拉曼信号大大增强，检测灵敏度大大提高。图1-4 纳米滚环复制增强SERS光斑效应在蛋白质微阵列检测中的应用Figure 1-4 Schematic illustration of enhanced SERS hot spots in protein microarray analysis表面增强拉曼散射虽然具有很多优点，但是也同时存在很多限制，例如：对特定目标分析物信号放大倍数不高、信号分布不均匀、吸附效应明显等。因此，在本课题中，将表面增强拉曼与DNA循环放大技术相结合，大大

55、提高了检测的灵敏度，避免了上述不足。4 DNA循环放大技术在DNA 生物传感器实际应用过程中，人们通常会引入DNA 循环放大技术，该技术能够有效的提高检测的灵敏度，其中包括一些常用的放大技术，如聚合酶链式反应、杂交链式反应、聚合酶链置换反应、滚环复制放大反应、链取代反应等。4 .1 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（即Polymerase Chain Reaction，PCR）是在生物体外放大扩增特定的DNA片段的常用方法。由于DNA在自然状态下呈现双链结构，在体外温度高于95 时会解链成两条单链，这时加入引物链，退火使引物链与母链根据碱基互补配对的原则杂交结合，在DNA聚合酶的作用下，沿着磷酸到

56、五碳糖的方向合成其互补链。经过 HYPERLINK /view/20616.htm t _blank 高温变性、低温退火以及适温延伸这几个简单步骤周期循环进行,最终使目的DNA得以迅速扩增，这种DNA扩增方法具有灵敏度高、 HYPERLINK /view/552529.htm t _blank 特异性强、对样品纯度要求低，省时且操作简单等优点。目前很多领域都应用到了PCR技术，它不仅可以检测基因序列、体外检测基因突变、帮助扩增特定DNA片段，还可以用于疾病的诊断，例如直接用于临床标本包括毛发、细胞、活生物组织、血液、体液等DNA扩增检测。4 .2 杂交链式反应杂交链式 HYPERLINK /f

57、anying_107169/ o 医学百科：反应 反应（hybridizationchainreaction, HCR）在生化分析领域应用广泛，其原理是基于自然状态下处于 HYPERLINK /yawentai_119500/ o 医学百科：亚稳态 亚稳态的发夹DNA，在体系中加入与发卡DNA部分互补的一条单链DNA启动分子，当单链DNA启动分子与亚 HYPERLINK /wentai_107137/ o 医学百科：稳态 稳态的发夹DNA结合时，发夹 HYPERLINK /jiegou_119288/ o 医学百科：结构 结构被打开，因此DNA发夹的空间构象因而 HYPERLINK /fash

58、eng_16282/ o 医学百科：发生 发生改变，发卡末端暴露在体系中，之后不断地结合并打开新的DNA发夹，最终得到一条条的长双链聚合体。Dietmar Knopp39等人利用杂交链式反应设计了一种高效检测人体免疫球蛋白IgG的方法。如图1-5所示，当IgG出现时，在金胶纳米粒子上即形成了夹心型免疫复合物，同时，由于金胶纳米粒子上众多DNA引发链的存在，即发生杂交链式反应HCR，大量的修饰了二茂铁分子的发卡结构被固定到了金胶粒子上，最终实现了信号的放大。此方案还有广泛的适用性，稍加改动即可实现其他蛋白质或者生物信标的检测。图1-5 杂交链式反应的工作原理示意图43Figure 1-5 Sch

59、ematic diagrams showing the design and operating principles of HCR43 4 .3 聚合酶链置换反应聚合酶链置换反应是指，在体系中加入一种含有内切酶特定识别位点的DNA单链模板、与模板部分互补的前体链（primer）以及特异性单链DNA内切酶、DNA聚合酶和单体脱氧核苷酸dNTPs，这时前体链primer DNA在聚合酶的作用下沿模板链向前生长，形成与模板链碱基完全互补的双链结构，此时在DNA内切酶的作用下，所形成的与模板互补的单链在内切酶特定识别位置被剪切，而前体链继续生长，进而替代原先形成的单链DNA，如此循环反应，最终可得到

60、大量的单链DNA。图1-6 基于聚合酶链置换反应检测端粒酶示意图Figure 1-6 Analysis of telomerase based on Strand-Displacement Polymerization Reaction 我们课题组40设计了一种利用聚合酶链置换反应检测端粒酶的方案，如图1-6所示，体系中加入两条引物链，在引物链1和端粒酶的共同作用下，末端修饰着荧光基团的发卡探针被打开，发出荧光，同时，由于系统中还存在引物链2，将发生聚合酶链置换反应，将引物链1置换重新进入体系中参与循环。4 .4 滚环复制循环放大反应在以这种机制进行的复制中，DNA聚合便可以将脱氧核糖核苷酸聚