卵子发育过程中染色质重构和基因转录调控(精)

1、基金项目:国家自然科学基金(编号30671161作者单位310006杭州浙江大学医学院附属妇产科医院卵子发育过程中染色质重构和基因转录调控瑜综述黄荷凤审校【摘要】卵子发育是复杂的生理过程。卵子发育过程中染色质结构发生显著的变化，经历由非环绕核仁型向环绕核仁型卵子的转变，并伴随基因转录活性的改变。表观遗传修饰在染色质重构和基因转录调节中发挥重要作用，主要通过组蛋白乙酰化/去乙酰化的平衡实现。颗粒细胞和卵细胞胞质的积聚可能为卵子染色质重构和转录抑制提供初始信号。对卵子发育过程中染色质结构和基因转录调控的表观遗传学变化综述。【关键词】卵子;表观遗传学;染色质重构:基因转录;组蛋白表观遗传学是研究DN

2、A序列不发生改变时基因表达的一种可遗传的亚稳定状态。表观遗传修饰作为基因表达调控领域研究的重要方面,能协助控制基因活性，以保证在特定类型的细胞中只有需要表达的基因才处于活化状态，而且这些信息能被储存并在细胞分裂时传递给下一代。基因转录前染色质水平的结构调整、核酸和蛋白质的甲基化、乙酰化和磷酸化等都属于表观遗传学的范畴，涉及染色质重构(chioniatuilemodeling和转录延续性。表观遗传在卵细胞发育过程中发挥重要作用1,在基因表达调控方面，包括基因印迹和染色质重构两方面。对卵子发育过程（特别是生发泡期染色质结构和基因转录调控的表观遗传学变化做文献综述。卵子的发育卵细胞发育在卵巢内进行,

3、经历增殖期、生长期和成熟期3个发育阶段。哺乳动物在胚胎期由卵黄囊内胚层经过变形运动沿后肠系膜迁移到生殖腺的原始生殖细胞,在性别分化后形成卵原细胞，经过一定次数的有丝分裂增加同类型细胞的数量、然后由卵原细胞发育形成初级卵母细胞。继而，初级卵母细胞进行生长、发育，积累各种营养物质，进行卵质分化及结构建造，合成和贮存胚胎发育所需的各类信息。初级卵母细胞完成生长后,进行两次成熟分裂。在此过程中出现两个停滞现象。第1次停滞是在第1次成熟分裂的前期（MI的双线期，此时，高度分散的染色质周围有完整的核膜淋为生发泡期（germinalvesicle,GV，卵在等待促性腺激素的信号或从抑制卵泡发育的环境中释放;

4、第2次停滞在第2次减数分裂中期（MII,卵等待受精。卵巢中的卵母细胞在发育的过程中并不是独立的，而是与其外周的卵泡细胞共同形成卵泡，以各期卵泡的形式共同发育。卵子发育过程中的染色质重构卵细胞发育过程中，细胞核发生着重要的变化，染色质结构和功能发生动态改变。根据染色质结构可将卵细胞分为两类2上环绕核仁（siuioiuidedCluomatinReconstmctionandGeneTianscnptionalRegulationDuiingOogenesisZHANGYu,HUANGHefeng.AffiliatedHospitalforGynaecologyandObstetricsofMed

5、icalCollegeofZhejiangUniversity,Hangzliou310006,ChinaAbstiactOocytematuiationisacomplexphysiologicalpfoceduie.Duiingoogenesis,oocvtenucleusexhibitsaumquecluomatinconfiguiation,whichchangesfiomlion-sunoundednucleolus（NSNtosuiioundednucleolus（SNaccompamedwiththealterationofgenetranscnptionalactivitv.E

6、pigeneticmodificationplaysanmipoitantroleuithislargescalecluomatmmodificationandgenetianscnptionalregulation,wlucliisniamlyregulatedbythebalanceofhistoneacetylation/deacetylation.Somesignalsprovidedbyaccuniulatmgofgranulosacellsandthecytoplasmoftheoocyte,mayplayaroleinthisprocess.Recentfindingsthatp

7、rovidemechanisticinsightmtocomplexrelationshipbetweencluomatmmodificationandgenetianscnptionalregulationduiiiigoogenesiswillbediscussed.KeywordsOocyteEpigenetics;Cluomatinmodification;Genetiansciiption;Histone(JhitReprodHealth蝴FamPlan,2009,28:16-19生殖医学(辅助生殖技术综述nucleolus,SN型特征是有一个Hoechst染色阳性的染色质环环绕核仁

8、，染色质聚集呈细丝状。非环绕核仁(notsunoundednucleolus,NSN型许寺征是Hoechst染色阳性的染色质分散，不形成环绕核仁的染色质环形结构。GV期卵母细胞的染色质是一种疏松的状态，即NSN型,在外来信号的刺激下，卵母细胞恢复减数分裂，在光镜下可以看见细胞核膜破裂，核仁消失,核内物质与核质混合，此过程即为生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBDc,在此过程中，起初分散的染色质显著凝集在核膜内缘，与核膜分解同步进行，同时，染色质变为异染色质并包含致密颗粒，形成一个异染色质环围绕核仁，形成SN结构。这种大范围的染色质结构改变已在多种哺乳动物的卵细胞

9、中发现，包括人类、牛和鼠等3。但是，羊4和马5的卵细胞例外、其染色质凝集发生在卵子发育的最后阶段，形成不同的结构。对鼠卵细胞的研究发现,NSN和SN这2种卵细胞核型在卵子成熟过程中均存在2。最初，卵子在减数分裂I的双线期处于NSN型，随着卵子的发育，或者保持NSN结构,或者向SN结构转变。SN型结构最早在直径达到4050pm的卵母细胞中发现，此直径的卵子中约占5%。而在直径7080pm的卵母细胞中,SN型卵子所占比例增高，约50%。与此相应,随着雌鼠年龄增大、NSN型和SN型卵子的比例发生显著变化。在1周龄雌鼠中,卵泡未达到窦腔水平（卵子直径40卩m,故卵子核型均呈NSN结构;2周龄雌鼠中一部

10、分卵泡达窦腔水平，小部分卵子呈现SN结构;4周龄左右，鼠进行第1次排卵期间，大部分卵泡达窦腔水平,NSN和SN结构卵子比例接近。到56周龄以上时,SN期卵母细胞占到90%o促性腺激素作用能够提高NSN向SN结构转化的比例。如,46周的雌鼠注射马血清促性腺激素（PMSG的4811后,SN/NSN卵子的比例明显增高，而在注射人绒毛膜促性腺激素（hCG、排卵之后，该比例恢复至两者接近水平。有研究提出NSN结构可能代表一种不成熟状态,不能引发排卵，而必须在排卵前向SN结构转变2。此外,也有学者提出，尽管在体外培养过程中，两种类型的卵子都能发生生发泡破裂,SN型卵子代表更成熟的阶段，对后续的受精和胚胎发

11、育均有影响。如NSN型卵子培养到MII,体外受精后合子不能发展到2细胞阶段以上，而SN型卵子受精后可以发育到囊胚阶段。而在鼠类中,2细胞期正是胚胎基因活化（EGA时期、是胚胎发育必须越过的第一障碍。在受精的最初的2011内，胚胎发育依靠在卵泡发育过程中积聚的母源性RNAs和蛋白质,而在第1次和第2次有丝分裂之后，胚胎开始转录自己的基因6。缺少或错误的EGA会导致胚胎死亡。因此,NSN结构来源的胚胎可能缺少促使这些基因向2细胞期过渡的必要的表观遗传修饰2。因此下述事实均证明，卵子的SN结构应该代表一种更为高级的发育状态:在窦前卵泡中,仅存在NSN结构;SN结构最初出现于出生后17d左右雌鼠中，为

12、排卵前卵子的主要结构。NSN型卵子直径较小。NSN型卵子体外培养时间长,成熟率低。SN型卵子体外培养受精后发育至4细胞期的比例高。卵子染色质重构和基因转录调控在人类和鼠的卵子中，染色质发生大范围的结构调整，即NSN和SN结构的转变与卵子基因代谢状态改变关系密切。对卵子体内发育和体外培养模型的研究均发现,NSN型卵子呈现高转录水平,可以合成各种类型的RNA,而SN型卵子则呈转录的全面抑制状态。NSN结构向SN结构转变，形成转录静止,排卵前卵子依靠储存的母源转录产物完成第1次减数分裂。在随后的受精和早期胚胎发育过程中，转录仍呈抑制状态。因此，转录静止对卵子成熟和早期胚胎发育是关键，而且转录抑制的时

13、机选择对后续胚胎发育也非常关键。人为延长转录抑制向减数分裂转变的时间(46d鼠的1个月经周期会降低胚胎的分裂率和囊胚形成率8。因此,GV期染色质重构是卵子基因转录调控的一种重要方式。染色质重构对卵子减数分裂和发育能力有重要影响。多项研究证实，两种类型卵子的转录活性不同。NSN型和SN型窦腔卵泡卵子的基因产物不同。Gentile等9应用单细胞半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR研究Cptl和Cpt2两种代谢基因的相对量，发现Cptl转录产物仅存在于NSN型卵子中;Cpt2转录产物在NSN型卵子中含量约为Mil卵子的两倍，而在SN型卵子中含量与Mil卵子相似,分为高含量和低含量两组。另有学者对两

14、种类型鼠卵子的polI和polII依赖性转录活性的研究发现，无论年龄和卵泡的大小,SN结构卵子的polI和poll【依赖性转录静止，而NSN卵子具有转录活性，而且当浓缩的染色质开始形成环形环绕核仁时，转录活性即降至零。尽管染色质重构与转录抑制的相关性具有重要的生物学作用，卵子发育过程中的染色质重构，即NSN向SN结构转化后，卵子形成全面转录抑制的细胞信号途径和相关分子机制并不清楚。GV期卵子的全面转录抑制发生在生发泡破裂和染色质浓聚之前，与体细胞不同。有学者用敲除Npm2的转基因鼠为模型、研究向SN结构转变和转录抑制的关系10(Npm2是一种与精子染色质重构相关的核伴侣,Npm2缺失的卵子呈现

15、异常的染色质结构11,可为研究响SN转变是否是卵子基因转录抑制所必须”提供模型。应用DNA荧光显象和转录活性检测同时分析染色质结构和转录活性，发现在Npm2缺失雌鼠中排卵前卵子不能向SN期转变，这些卵子呈现杂乱的核型，核质中的染色质保持分散，形态学上类似未成熟的卵子,但转录仍全面抑制。同样,外界因素促使已形成SN结构的排卵前卵子染色质去凝缩后仍不能使其恢复转录活性。这些结果表明，卵子的染色质重构、向SN结构转变并不是GV期卵子转录全面抑制必需的。也就是说，尽管两个过程在时间上相关，均发生在排卵前卵子中,大范围染色质结构改变和全面转录抑制是可以分离的。除广泛的染色质结构变化外,GV期卵子进行继续

16、减数分裂前的转录状态改变可能有其他的机制。卵子染色质重构与组蛋白去乙酰化已知有3种机制参与染色质构型的改变依赖于ATP的染色质重构、组蛋白移位和染色质的共价修饰（covalentcluomatmmodificationo其中染色质的共价修饰既可发生在DNA上也可发生在组蛋白上。DNA的修饰主要是胞喀唳的甲基化，而组蛋白的共价修饰则包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和ADP-核糖化12,由此构成多种多样的组蛋白密码。染色质模板与不同组蛋白变量连接，加上组蛋白尾端的氨基酸终末的转录后修饰，形成了哺乳动物基因的表观遗传修饰。以上3种不同的调节机制间可互相转换，以一种共同协作的状态来完成对染色质结构的

17、调控。组蛋白的末端共价修饰对基因表达调控有很明显的作用，可通过改变染色质的疏松或凝聚状态或通过影响其他转录因子与结构基因启动子的亲和性发挥基因调控作用。组蛋白的乙酰化平衡由组蛋白乙酰基转移酶（histoneacetyltiansfeiases,HATs和组蛋白去乙酰基酶（histonedeacetylases,HDACs调节。乙酰化的染色质与转录激活有关，而去乙酰化的染色质则与转录抑制有关。组蛋白乙酰化与去乙酰化平衡引起染色质结构改变及基因转录活性变化的机制至少包括以下方面13-14:组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化能使组蛋白携带正电荷量减少，降低其与带负电荷的DNA链的亲和性，导致局部DNA与组

18、蛋白八聚体解开缠绕,从而促使参与转录调控的各种蛋白因子与DNA特异序列结合，因而对基因转录有利;而局部组蛋白的去乙酰化可稳定核小体结构，并且恢复组蛋白与DNA及组蛋白与组蛋白之间的作用,进而阻碍DNA与转录因子及转录机器结合。组蛋白的去乙酰化氨基末端尾巴可与参与维持染色质高级结构的多种蛋白质相互作用，稳定核小体的结构，而组蛋白乙酰化却减弱了上述作用，阻碍了核小体装配成规则的高级结构（如螺线管。HATs对相关的转录因子或活化因子进行乙酰化修饰以调节基因的表达，而HDACs则可以中和HATs的作用。GV期卵子的染色质重构是一个复杂的生理过程，其中组蛋白乙酰化与去乙酰化状态改变起到关键的作用。组蛋白

19、乙酰化使卵细胞染色质具有开放性结构而使转录活性增强。相反，组蛋白去乙酰化则导致目的基因启动子区域转录抑制，或者诱导染色质序列的调整从而改变染色质结构。在卵子发育过程中，乙酰化/去乙酰化平衡为细胞周期依赖性，受到细胞代谢状态和细胞外信号的调节15。在MI期，卵细胞进行继续减数分裂前，染色质组蛋白经历程序化的去乙酰化，这与HATs/HDACs平衡有关，并在MI后期和MII期,维持去乙酰化状态。因此、组蛋白去乙酰化作用对卵子染色质重构及转录状态调节具有重要的作用,并通过HDACs发挥作用。HDACs参与卵子减数分裂中的染色质重构。在减数分裂之前，卵细胞染色质发生广泛的组蛋白去乙酰化，这在小鼠16和猪

20、15的卵细胞中已经证实。Sarmento等16发现，小鼠卵细胞DNA的组蛋白H4在GV期以高度乙酰化的状态存在，而在MI【期、受精卵和早期胚胎中乙酰化水平明显下降。Endo等15用免疫细胞化学方法(unmimocytochemicalanalyse对猪卵细胞发育过程的多个组蛋白位点进行研究发现,GV期卵子所有检测组蛋白的赖氨酸均呈高度乙酰化状态，且持续至MI前中期；到中期，检测位点出现完全去乙酰化或乙酰化水平明显下降，在MI的后期和末期，检测位点乙酰化水平出现短暂增高、随后，到MII期又回落至MI中期水平。HDACs参与GV期鼠卵子SN结构的维持。用HDACs阻滞剂TSA处理具有SN结构的排卵

21、前卵子，可导致染色质结构的改变，特别是常染色质发生明显的去凝缩，形成分散结构、而核仁外周的着丝粒异染色质环对TSA的反应有限,仍在核仁周围保持致密的结构。所以，尽管TSA处理仅部分干扰了异染色质环,HDACs的阻滞能导致常染色质的分散破坏SN结构。但是,TSA处理后的卵子并不能回复至NSN结构10oHDACs还与异染色质形成的表观遗传修饰有关。在动物细胞减数分裂中,HDACs调节的组蛋白H3/H4的乙酰化水平与异染色质连接蛋白在染色体亚区的定位有关。对鼠卵细胞的研究表明17、减数分裂中的广泛去乙酰化是ATRX蛋白(种染色质重构蛋白准确连接到染色质着丝粒异染色质区必须的。相反，用TSA阻断HDA

22、Cs使染色质高度乙酰化，可干扰ATRX与染色质中心区域的连接，导致减数分裂中染色质结构的异常。这表明，全面组蛋白去乙酰化是ATRX与着丝粒异染色质连接必需的。卵子染色质重构的调节机制到目前为止，卵细胞染色质重构和转录抑制的初始机制并不清楚,颗粒细胞和卵细胞胞质的积聚可能为其提供信号18。有研究表明，颗粒细胞在调节卵细胞转录活性及染色质重构方面均具有重要作ffloDeLaFuente等10应用HoechstDNA染色和免疫细胞化学检测Br-UTP的方法分析成熟卵子的染色质重构和转录活性发现,未成熟卵细胞与相应颗粒细胞复合体在体外培养后发生染色质凝缩、NSN向SN结构转化,同时转录活性消失。与体内

23、发育卵子转录活性调节相同，且转录抑制的比例与体内促性腺激素刺激后发育的卵子接近。在无颗粒细胞伴随的情况下，裸露的卵细胞体外培养后转录活性一直不消退。该结果表明，卵子与颗粒细胞紧密连接是卵子发生染色质重构的必要条件。但颗粒细胞调节染色质重构和转录抑制的机制尚不明确。一些研究表明，在卵泡发育过程中，卵子成熟和分化依靠在卵子和颗粒细胞间形成的不同裂隙传递间的特异性双向交流19-20。在颗粒细胞存在的情况下，可提供一些信号，使GV期卵子转录抑制。另有研究表明，卵子成熟过程中，卵细胞胞质的积聚也可以为转录抑制和染色质重构提供信号。Bowk等18对GV期SN型卵子与8细胞期卵裂球融合模型体外培养的研究发现

24、，在GV期SN卵子胞质的影响下，卵裂球也出现染色质凝缩，转录抑制，并伴随组蛋白的广泛去乙酰化，但是核膜不破裂。而与卵细胞不同的是10,用TSA处理后，卵裂球重新出现转录活性，因此，尽管卵细胞胞质能对胚胎提供信号，使其染色质重构，但基因调节机制在卵子和胚胎中是不同的。综上所述,卵子发育过程中染色质结构发生显著变化，伴随基因转录活性的改变。表观遗传修饰在染色质重构和基因转录调节中发挥重要作用，主要通过组蛋白乙酰化/去乙酰化的平衡实现，但目前为止其初始机制并不清楚。卵子正常发育、成熟是后续受精过程及胚胎发育正常进行的基础。因此对卵子发育和成熟过程的进步研究不仅能够加强对生命发育初始阶段的认识，而且在

25、辅助生殖技术发展的今天具有更加重要的现实意义。参考文献Biomf1eldJMessamoieW,AlbertiniDF.EpigeneticregulationduiingmanunaliaiioogenesisJ.RepiodFertilDev,200&20(l:74-80.ZuccottiMGaiaqnaS,MexicoV,etal.CluomatinorganisationandnuclearaiclutectuieingrowingmouseoocvtesJ.MolCellEndoc-nnoL2005,234(l-2:11-17DeLaFuenteR.Cluomatmmodificat

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32、-垂体-性腺轴共同参与生殖过程中性成熟、配子生成和类固醇激素合成等的调节。GH在临床中有一定的应用价值。GH与IGF-1在两性生殖各个方面有重要作用GH轴与生殖有密切联系，但仍有许多未解决的问题。研究认为，促生长轴会影响人类的衰老过程。能否通过某些方式调节GH和IGF-1系统的作用来延长人类和动物的生育期有待进一步研究。参考文献ChandiashekarV,ZaczekD.BartkeA.Tlieconsequencesofalteredsomatotropicsystemon1epioductionJ.BiolRepiod,2004,71(l:17-27.KeeneDE.SuescunMO.

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