分子克隆讲稿

1、关于分子克隆第一张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一节概 述第二张，PPT共二百页，创作于2022年6月基因工程（gene engineering ）： 将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的遗传性状所用的方法及相关的技术。 基因工程实际上包括两部分技术：分子克隆和基因表达，前者是上游技术，后者是下游技术。（一）基因工程的有关概念第三张，PPT共二百页，创作于2022年6月克隆来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体。 基因型（genetype）相同的细胞或生物体的一个群体。 最常用的是描述一

2、个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNA片断的载体分子。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。第四张，PPT共二百页，创作于2022年6月分子克隆（也称基因克隆或DNA克隆） 指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体DNA重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。 又称重组DNA技术（DNA recombination）。 第五张，PPT共二百页，创作于2022年6月第六张，PPT共二百页，创作于2022年6月理论上的3大发现：1. 20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。2. 20世纪

3、50年代，Watson-crick弄清了生物遗传物质的分子机制：阐明了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。 3. 20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码。（二）基因工程的技术准备第七张，PPT共二百页，创作于2022年6月技术上的3大发明： 1.“基因剪刀”限制性内切酶的发明1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了Hind2.载体：1973年Cohen将质粒作为基因工程载体使用3.逆转录酶1970年Baltimore和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学中心法则，使真核基因

4、的制备成为可能。第八张，PPT共二百页，创作于2022年6月（三）基因工程主要内容基因工程的名称：基因工程，又称重组DNA技术，基因操作，基因克隆，分子克隆等。基因工程实施的四个必要条件：工具酶，基因，载体，受体细胞。基因工程的两个基本特点：1.分子水平操作；2.细胞水平表达。克隆基因的目的：1.扩增DNA；2.获得基因产物；3.研究基因表达调控；4.改良生物的遗传性。第九张，PPT共二百页，创作于2022年6月第二节 工具酶Tool Enzyme 第十张，PPT共二百页，创作于2022年6月工具酶 在分子克隆技术中，DNA的合成、切割、连接、补平、修饰和重组是由一系列酶促反应所完成，有关的各

5、种酶被统称为工具酶。第十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月常用的工具酶主要有： 一、限制性核酸内切酶 二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 四、碱性磷酸酶 五、多核苷酸激酶 六、核酸酶S1 第十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月一、限制性内切酶（ restriction endonuclease ）概念：能够识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。分类：、型，常用为类酶第十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月限制酶的分类I型限制酶：具有限制和DNA修饰作用，这种酶通常在识别位点上、下游1001000bp处切割DNA；型限制酶：与I型酶一样

6、，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测；型限制酶：能在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。第十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。第十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月限制酶的命名限制性核酸内切酶的命名原则1973年H.O.Smith和D.Nathams

7、首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。第十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 Hind Hind同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月

8、EcoR I产生该酶的 宿主菌属名微生物的种名 宿主菌的株或型同一菌株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）第十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月型限制性核酸内切酶的作用识别双链DNA特异的核苷酸序列，通常48个碱基对在识别序列特定的位点上精确切割双链DNA分子第十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月型限制酶的识别和切割位点特点：4-8个bp，具有回文结构的DNA片段1、粘性末端：在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾的粘性末端2、平末端：切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝端(blunt end)。第二十张，PPT共二百页，创作于2022年6月第二十一张，PPT共二

9、百页，创作于2022年6月第二十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月 特殊性质的型限制酶：（1）同裂酶：又称同工异源酶，是从不同的原核生物中分离出来的不同的酶。它们识别相同的序列，在切割DNA时，其切割点可以是相同的，也可以是不同的。例如：Aha 和Dra的识别和切割序列都相同，产生平端：第二十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月Kpn和Asp718的识别位点相同，但切割位点不相同，前者产生3粘性末端，而后者产生5粘性末端第二十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月（2）同尾酶：有些限制酶的识别序列不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端，故称为同尾酶。例如Mbo、BamH、Bg

10、l的识别切割序列分别为：第二十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月(1)DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量加大反应总体积延长反应时间限制性核酸内切酶反应影响因素第二十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月(2)DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI 等。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等。采用去甲基化酶的大肠杆菌

11、菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。第二十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月(3) 酶切反应的温度多数标准反应温度是37，特殊如SmaI为25或30 ，SfiI为50 。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。(4)DNA分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。第二十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月 (5)核酸内切酶的缓冲液 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。第二十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月1.DNA重组 2

12、.DNA序列分析 3.制备DNA探针 4.基因定位5.组建新质粒限制酶的主要用途：第三十张，PPT共二百页，创作于2022年6月限制性核酸内切酶在分子克隆中的用途： 切割DNA以获取目的DNA片段 切割载体DNA形成切口 使目的DNA片段能插入载体 第三十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月作用：能够催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子形成磷酸二酯键，实现DNA重组。 连接作用所需条件 (1)一条DNA链的3末端具有一个游离的-OH; (2)另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团-P; (3)需要辅酶NAD或ATP。353 5OHP二、DNA连接酶（1967年发现）第三十二张，PP

13、T共二百页，创作于2022年6月T4 DNA连接酶的作用机制：ATP+DNA ligase(E)E-AMP+PPi。E-AMP上的AMP转移到DNA的5磷酸根上，使其活化，释放出酶。活化的5磷酸根与相邻的3羟基形成3，5磷酸二酯键，并释放出AMP。 第三十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月第三十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月第三十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP5 G-C-T-

14、C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknick第三十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C -T-C 5第三十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月连接多个平头双链DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A

15、-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶第三十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月 大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。第三十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月 连接酶在分子克隆中的用途: 能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用,形成重组的DNA分子。 第四十张，PPT共二百页，创作于2022年6月三、DNA聚合酶 共同特点：能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP)连续地加到DNA链

16、的3-OH末端，催化脱氧核苷酸的53聚合作用。 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 逆转录酶Taq DNA聚合酶 末端脱氧核苷酸转移酶 第四十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月1.大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I） （1） E.coli 的DNA聚合酶系统Pol I 参与DNA修复, 具53 核酸聚合酶活性、35和53外切酶活性pol II 参与DNA修复，具53 核酸聚合酶活性、 35 和53外切酶活性pol III 参与DNA复制, 具53 核酸聚合酶活性、 35 外切酶活性 第四十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月（2） E.coli polI的特点

17、 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性 聚合酶活性：53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 外切酶活性：在枯草杆菌蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 第四十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月第四十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月（3）E.coli polI大片段(Klenow 片段)Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶处理,获得三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但

18、失去了5 3的核酸外切酶活性。 第四十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端抹平DNA的3粘性凸出末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列第四十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月第四十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月第四十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月（1）T4 DNA聚合酶的基本特性：有35的核酸外切酶活性和53的DNA聚合酶活性。在无dNTP时，可以从任何3 -OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。2

19、.T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase)第四十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月（2）基本用途第五十张，PPT共二百页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月3.逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录酶是一个多功能性酶，具有以下3种酶活性： 以单链RNA为模板， 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交 链中的RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。第五十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月逆转录过程杂合双链DNA-RNA单链RNA水解杂合中的RNA双链DNA

20、RNA指导的DNA聚合酶RNAase HDNA指导的DNA聚合酶第五十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月第五十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月4、Taq DNA聚合酶是从嗜热水生菌（Thermus aquaticus YT1菌株）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，该酶在92.5 、95、97.5 的半衰期分别为130分钟、40分钟、56分钟。 Taq pol特点：有强的53 DNA聚合酶活性有5 3核酸外切酶活性无3 5 核酸外切酶活性第五十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月 Thermus aquaticus from hot springs in Yellowsto

21、ne National Park, USA.第五十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月 5、末端脱氧核苷酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT) 作用 将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。第五十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月 -P32 dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32应用 探针标记 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，形成人工粘性末端，以便于进行连接第五十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月 四、碱性磷酸酶

22、 （alkaline phosphatase） 能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。 用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。第五十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月第六十张，PPT共二百页，创作于2022年6月T4 DNA连接酶15C+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连第六十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月五、T4噬菌体多核苷酸激酶 该酶可催化ATP的磷酸转移到DNA或RNA5-

23、OH末端。 1、在杂交探针制备中，可用来标记DNA片段的5端；2、基因的化学合成中，使寡核苷酸片段5磷酸化；3、DNA测序中，测序引物5磷酸标记。用途：第六十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月第六十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月六、S1核酸酶 S1核酸酶主要功能是催化RNA和单链DNA分子降解为5单核苷酸，同时也能作用于双链DNA分子的单链区，并从此切断DNA分子。dNMPs，drNMPspH4.5pH4.5Zn 2+Zn 2+第六十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月第三节 载体Vector第六十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月载体(vector)的概念

24、是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。 载体化学本质为DNA分子。第六十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月 载体必须具备的基本条件具有独立复制能力具备多个限制酶的单一识别位点(多克隆位点)具有遗传筛选标记有较多的拷贝数具有遗传稳定性第六十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月载体分类 按照载体的复制子来源划分，可分为以下四种类型：1) 质粒型载体2) 病毒型载体（噬菌体载体）3) 混合型载体（粘粒-cosmid、 噬粒-phagemid）4) 人工染色体载体（酵母人工染色体载体YAC、细菌人工染色体载体BAC、哺乳动物人工染色体载体

25、HAC等）第六十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月按载体适合的宿主细胞分类： 1)原核细胞载体 2)真核细胞载体 3)穿梭载体（shuttle vector）载体分类第六十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月按照载体的功能或用途来划分，则可将DNA载体分为以下两大类：1) 克隆型载体 (cloning vector)2) 表达型载体 (expression vector) 载体分类第七十张，PPT共二百页，创作于2022年6月一、克隆载体概念：能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。 常用的克隆载体： 质粒载体 噬菌体载体 粘粒载体（由质粒和噬菌体

26、构建而成） 酵母人工染色体（YAC） 第七十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月（一）质粒载体 质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制并表达其携 带的遗传信息。 质粒特性：自主复制性、不相容性、可扩增 性、可移动性 第七十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月 具有松弛型复制子； 具有限制酶的酶切位点； 具有插入失活的筛选标记； 相对分子量小，有较高的拷贝数。理想质粒克隆载体的条件： 常用的质粒载体有pBR322和pUC系列第七十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月1、大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建载体pBR322是由一系列大

27、肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建的一种双链环状克隆载体。由Bolivar 等人于1977年构建的。第七十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月PBR322质粒是按照标准的质粒载体命名法则命名的。 “p”表尔它是一种质粒，用小写； “BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者 F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母； “322”系编号，以与其它质粒载体如pBR325、pBR327及pBR328等相区别。第七十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月pBR322质粒结构特点： 1）分子量小仅4.36kb2）有一个高拷贝复制起点(ori)； 3）有2个抗性基因（Am

28、pr和Tetr)； 4）抗性基因内分别有若干限制酶的单一切点(MCS,multiple cloning sites)，用于目的基因的插入，可使1个抗性位点插入失活，另1个抗性位点作为选择标记。 第七十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月pBR322质粒的物理图谱第七十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月pBR322质粒载体的结构来源TetrAmprOri第七十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月2. pUC18/19质粒载体 pUC18/19质粒载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA克隆载体。pUC是系列质粒载体。此类质粒载体之所以取名为pUC，是因为

29、它是由美国加利福尼亚大学(University of California)的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建的。 第七十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月pUC质粒结构特点：1） pUC载体较小，全长仅2686 bp；具有更高的拷贝数(500 - 700个)2）只保留了一个药物抗性基因Ampr3）大肠杆菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列LacZ 基因；4）有一个多克隆位点区，极有利于克隆外源基因。第八十张，PPT共二百页，创作于2022年6月第八十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月第八十二张，PPT共二百页，创作于20

30、22年6月如何筛选？（1）2.69kb，保留了pBR322质粒的Ampr，转化菌可在氨苄青霉素培养基中存活； （2）LacZ基因 编码-半乳糖苷酶的一个片段( -片段)，与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补成为完整的酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，菌落呈蓝色； （3）LacZ基因中有MCS 外源基因插入，使LacZ基因插入失活，不能表达a-片段， 不能与宿主细胞互补，X-gal不能转变为蓝色，表现白色菌落。第八十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月异丙基-D-硫代半乳糖苷5-溴-4氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷第八十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月（二）噬菌体载体第

31、八十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌的病毒。 噬菌体的核酸： 双链线性DNA（最常见）；单链线性DNA；双链环形DNA；单链环形DNA ；单链RNA第八十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月 噬菌体的分类：溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细菌后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。 溶原性噬菌体：指噬菌体感染细菌后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中去，和细菌染色体一起复制。 第八十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月(1)溶菌性噬菌体的生活周期第八十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月裂解循

32、环溶源态（2）溶原性噬菌体的生活周期第八十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月噬菌体（温和型）颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子；噬菌体长48502bp，两端各有12个碱基的5凸出黏性末端（cos位点）是互补的，进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化； 噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。1. 噬菌体载体（1）噬菌体的分子生物学概述第九十张，PPT共二百页，创作于2022年6月GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用第九十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月第九十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月 基因组太大（约49kb）； 酶切位点太多，

33、它有5个BamH1位点，6个Bg位点，5个EcoR位点； 野生型只能接纳一定长度的DNA （约2.5kb ）。（2）噬菌体的缺陷与改造：缺陷第九十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月改造 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； 去除太多的酶切位点，每种酶只留1-2个切口； 增加标记基因。第九十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月（3） 噬菌体载体 主要有如下特点：1)筛选简便；2)可克隆的片段大，最大可达25 kb，（质粒最大仅10 kb左右）3)转染效率高：可在体外包装，产生有感染性的噬菌体颗粒，每个颗粒都可能感染一个大肠杆菌。第九十五张，PPT共二百页

34、，创作于2022年6月插入型载体只有12种限制性核酸内切酶的单一切割位点 大肠杆菌-半乳糖苷酶失活 第九十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月第九十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月置换型载体载体中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段;在构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列;当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。 第九十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月噬菌体的结构外源基因直接插入单一酶切位点可置换9-22kb目的DNA第九十九张，PPT共二百页，创作于2022年

35、6月第一百张，PPT共二百页，创作于2022年6月2 M13噬菌体载体M13噬菌体属丝状噬菌体；其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质，有10个基因；有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。 （1） M13 噬菌体的分子生物学概述第一百零一张，PPT共二百页，创作于2022年6月（2）M13噬菌体产生单双链DNA的机制1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。第一百零二张，PPT共二百页，创作于2022年6月3、单链特异DNA结合蛋白结合在（+）

36、链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 第一百零三张，PPT共二百页，创作于2022年6月+-+-+-+-+-+-单链结合蛋白RF型DNA复制约200copy+以-链DNA为模板合成+链DNA第一百零四张，PPT共二百页，创作于2022年6月基因组小于10kb复制的双链形式类似于质粒载体利用M13作载体可以

37、获得单链的DNA噬菌体颗粒。 （3）M13作为克隆载体的理由：第一百零五张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百零六张，PPT共二百页，创作于2022年6月现在所使用的 M13 噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的 mp 系列载体，以基因 和基因 之间的区域作为外源 DNA 插入区。mp 载体系列在间隔区内的 Hae 位点插入了一小段大肠杆菌LacZ基因，引入 互补筛选。第一百零七张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百零八张，PPT共二百页，创作于2022年6月 是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。受体细胞是大肠杆菌。 粘粒结构特点：具有质粒和噬菌体的特点 质粒的复制起

38、点(Ori)； 携带抗生素抗性基因； 具有用于插入目的基因的单一酶切位点； 噬菌体的cos位点。 （三）粘粒(cosmid)载体第一百零九张，PPT共二百页，创作于2022年6月 粘粒主要作用特点：粘粒载体大小为46kb，而插入外源 基因长达4050kb。 粘粒用途： 克隆大片段真核DNA。 构建基因组文库。 第一百一十张，PPT共二百页，创作于2022年6月以粘粒为载体克隆原理及步骤1分离长4050kb外源DNA片段2外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同 3体外包装 在噬菌体的A蛋白的作用下切割cos位点并将其中的重组DNA包装到成熟的噬菌体颗粒中去 4感染E.coli：线状的重组DN

39、A被注入细胞并通过cos位点的环化，象质粒一样复制第一百一十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月粘粒的作用模式图第一百一十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色体DNA和大肠杆菌pBR322改造而成；受体细胞是酵母细胞；可以插入长达1000 Kb的外源DNA片段。 （四）酵母细胞中克隆基因常用载体第一百一十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月YAC主要调控元件着丝粒 保证染色体细胞分裂过程中正确分配到子代细胞端粒 防止染色体被核酸外切酶降解的功能复制起始点和限制性酶切位点第一百一十四

40、张，PPT共二百页，创作于2022年6月筛选标记 YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵母中选择标记一般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选原核序列及调控元件 包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作第一百一十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月YAC作为载体的主要特点酵母是单细胞真核生物，培养方便；酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因；装载容量巨大，可达Mbp水平；YAC的克隆程序相似于基因组DNA的常规克隆；DNA在片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，随后该重组体可通过常规方法导入酵母；第一百一十六张，PPT共二百页，

41、创作于2022年6月酵母人工染色体载体的特点： 能在大肠杆菌中复制，并具有较高的拷贝数； 携带有在酵母细胞中便于选择的遗传标记； 含有用于插入目的基因的限制酶切位点。 第一百一十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月 已构建并经常使用的动物病毒克隆载体有：猿猴空泡病毒40(SV40)载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等，它们都有各自的特点和应用范围。 受体细胞是动物细胞。（五）动物细胞基因克隆的载体第一百一十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月几类常用克隆载体比较第一百一十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月二、表达载体理想的表达载体应具备的特征： 能自我复制并具较高的拷贝数，分

42、子量适宜，一般10Kb。 带有遗传筛选标记，如抗生素抗性基因。 具有多克隆位点（MCS），容易插入外源基因。高效的转录调控元件，如强启动子及其调控序列、目的基因表达的正确阅读框架、强终止子等。具有翻译起始信号第一百二十张，PPT共二百页，创作于2022年6月（一）原核细胞表达载体原核细胞表达载体最主要大肠杆菌表达载体。载体构建是在克隆载体的基础上加入表达系统调控元件：启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号第一百二十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百二十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百二十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百二十四张，PPT共二百页，创

43、作于2022年6月第一百二十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月非融合型表达载体 PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合基因第一百二十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月将带有起始密码ATG的真核基因插到原核启动子和SD序列的下游，组成1个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，可得非融合蛋白。非融合蛋白未与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起，具有非常近似于真核生物体内蛋白质的结构，生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质，缺点是容易被细菌蛋白酶破坏。 第一百二十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月1) 来源： 哈佛大学Brosius等构建2) 用途： 原核表达 第一百二十八

44、张，PPT共二百页，创作于2022年6月分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列等信号肽序列 (SS) ：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。 第一百二十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月分泌型表达载体-pINIII-ompA1第一百三十张，PPT共二百页，创作于2022年6月融合蛋白(fusion protein)载体融合蛋白即编码原核多肽DNA序列与编码真核多肽cDNA融合成一体后表达出来的一种蛋白。N端由原核DNA序列编码，C端由真核基因完整序列cDNA编码。表达融合型蛋白时，为了得到正确的真核蛋白，在插入真核基因时，其阅读框架与融合的DNA片

45、段的阅读框架要一致，翻译时，才不至于产生移码突变。 第一百三十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月融合蛋白表达的优点及其意义 伪装不易降解 其中真核蛋白由原核多肽伪装，不易被细菌蛋白酶降解，稳定； 大多数以可溶性形式存在，不需切割就有生物活性； 易酶切分离 如肠激酶或设计酶切位点切掉原核多肽，即可释放出有活性的真核蛋白； 易分离纯化第一百三十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月融合型载体-pGEX系列第一百三十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月（二）真核细胞表达载体真核细胞表达载体主要有酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达载体。另有植物细胞。除原核细胞克隆载体元件外，还含有真核细胞

46、中的筛选基因和真核表达元件，有的含真核复制起始点等。真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止子加poly A信号第一百三十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月真核生物启动子保守序列第一百三十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百三十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月 CMV promoter/enhancer: 309-819sgGFP Moiety: 913-1560HIV-1 vpr: 1561-1926BGH poly A: 1998-2222SV40 promoter: 2746-3071Neomycin: 3107-3901SV40 poly A: 4075-

47、4205pUC origin of replication: 4465-5242Ampicillin: 6266-5406第一百三十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月第四节 分子克隆的基本步骤Basic Procedure of DNA Cloning第一百三十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月分子克隆的操作过程主要由以下步骤组成： 目的基因的获取 （分）； 载体和目的基因的切断（切）； 载体和目的基因的重组（接）； 重组DNA导入受体细胞 （转）； 重组DNA的筛选和鉴定 （筛）； 外源基因的蛋白表达 （表）。 第一百三十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百四十张

48、，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百四十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月vectorrestriction endonuclease重组DNA技术流程简图foreign DNAbacterial cell第一百四十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月ligase重组DNA技术流程简图vectorrestriction endonucleaseforeign DNAbacterial cellhost第一百四十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月 研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。目的基因：人们感兴

49、趣进行研究与应用的某些基因或DNA片段，即为目的基因。 一、 目的基因的获取（分） 第一百四十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月目的基因 需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系第一百四十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月直接从染色体DNA中分离：原核生物人工合成从基因组文库获取从cDNA文库获取PCR扩增目的基因的来源：第一百四十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月直接分离原核细胞基因组较小，可直接分离获得 基因组 限制性内切酶切 水解成若干片段 探针筛选 提纯 扩增 第一百四十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月人工合成

50、某一基因的核苷酸序列已知，或者根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。第一百四十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列第一百四十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月基因组文库 （ G-文库 ）是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。 第一百五十张，PPT共二百页，创作于2022年6月cDNA文库（ C-文库 ）是指将某种生物体基因组转录的全部m

51、RNA,经反转录产生cDNA片段,再分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 第一百五十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百五十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月二、 载体的选择 1）质粒载体可承载15kb左右DNA片段 (有效的范围为10kb) 2）载体可承载25kb 左右DNA片段(有效的范围为15 kb) 3）Cosmid 载体可承载45kb 左右DNA片段(有效的范围为40 kb) 4）酵母人工染色体可承载250400kb DNA片段 第一百五十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月三、目的基因和载体酶切与连接（切、接）目的

52、基因与载体DNA分子进行重新组合过程（DNA连接酶）粘性末端连接法平端连接法同聚物加尾连接法人工接头(linker)连接第一百五十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月（1）粘性末端连接法第一百五十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月 （2） 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端第一百五十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连第一百五十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百五十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月（3）同聚物加尾连接 在末端转移酶(te

53、rminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。第一百五十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百六十张，PPT共二百页，创作于2022年6月（4）人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 第一百六十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月人工接头及其应用5-3-CCGAATTCG GGCTTAAGCEco REco REco REco R第一百六十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月受体菌条件: 处于感受态(competent)安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷

54、遗传表型具有互补性（四）重组DNA导入受体菌（转）第一百六十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月受体细胞分为原核细胞和真核细胞两大类。常用的原核受体细胞是大肠杆菌。 受体细胞条件：处于感受态 感受态细胞(competent cell) 细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。 第一百六十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月2. 导入方法:CaCl2转化法电穿孔法磷酸钙共沉淀法噬菌体的转染 脂质体法 显微注射法第一百六十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月（1）CaCl2转化法： 当细菌处于0、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球

55、形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击后，吸附在细胞表面的DNA复合物进入细胞，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。第一百六十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月细菌0二价阳离子Ca2+、Mg2+42第一百六十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月（2）电穿孔法（electroporation）： 在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。 实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高1091010/ug第一百六十八张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百

56、六十九张，PPT共二百页，创作于2022年6月（3）磷酸钙-DNA共沉淀法： 将被转染的DNA和正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性DNA形成沉淀颗粒附着在细胞表面，通过细胞脂相收缩时裂开的空隙进入或在钙、磷的诱导下被细胞摄取，通过内吞作用进入受体细胞。第一百七十张，PPT共二百页，创作于2022年6月（4） 噬菌体的转染 将重组的噬菌体DNA在体外包装成具有感染力的成熟噬菌体颗粒，然后使这些带有目的基因片段的重组体DNA能按照正常的噬菌体感染过程导入宿主细胞。第一百七十一张，PPT共二百页，创作于2022年6月转化（transformation） 以质粒DNA或以它为载体构建的

57、重组子导入受体细胞的过程称为转化。 转染（transfaction） 是指以噬菌体DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过程称为转染。感染(infection) 具有感染力的噬菌体将头部重组子导入受体细胞的过程称为感染.第一百七十二张，PPT共二百页，创作于2022年6月五、重组体的筛选和鉴定（筛） 重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）。 第一百七十三张，PPT共二百页，创作于2022年6月筛选阳性克隆针对重组子遗传表型改变的初步筛选法 抗生素平板筛选 蓝白斑筛选分析重组子结构特征的进一步筛选法 内切

58、酶图谱分析 核酸杂交 PCR分析重组子表达产物的筛选方法 免疫化学检测法 转译筛选法 基因表达产物分析法阳性重组子的最后鉴定 核酸序列测定第一百七十四张，PPT共二百页，创作于2022年6月（一）遗传标记表型特征筛选 1抗生素抗性标记筛选 大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr 、Tetr等）。 第一百七十五张，PPT共二百页，创作于2022年6月抗生素平板筛选 具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；否则不能生长。 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细菌就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。第一百七十六张，PPT共二百页，创作于2022年6月第一百七十七张，PPT共二百页，创作于2022年6月 2. 蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂