医学微生物学：厌氧菌

1、厌氧菌(Anaerobic bacteria) 第一节 概述一、厌氧菌的种类与人体分布：定义：在有氧条件下不能生长，无氧的环境中才能生长的细菌。（缺乏完善的酶系统，只能以无氧发酵进行能量代谢）分类：(1)生物学分类: 1.G+有芽胞杆菌(130多种），1个属 2.G+无芽胞杆菌、G-无芽胞杆菌、G+厌氧球菌、G-厌氧 球菌 （300多种），40多个属 (2)对氧耐受程度分类: 对氧极端敏感的厌氧菌(丁酸弧菌) 中度厌氧菌(脆弱拟杆菌) 耐氧厌氧菌(溶组织梭菌) 分 布 自然界广泛分布，是人体正常菌群，其中肠道中厌氧菌量最多。无芽胞厌氧菌存在人和动物体内，口腔，肠道，上呼吸道，尿生殖道。与需氧菌

2、，兼性厌氧菌构成正常菌群。如肠道中厌氧菌占99.9%。如1克大便1000亿个，如大量使用广谱抗生素，机体免疫力下降，进入非正常部位，作为条件致病菌，引起内源性感染。 人体各部位厌氧菌寄生量及其与需氧菌之比 _ 厌氧菌数量 眼结膜 鼻涕 唾液 牙表面 牙周袋与牙垢_（cfug） 1034 1014 1089 10910 101112 厌氧菌与需氧菌之比 10:1 10:1 810:1 1:1 1000:1 _ 厌氧菌数量 胃液 结肠 小肠 阴道 外尿道 皮肤_ （cfug） 1025 101112 1046 1089 1035 1034厌氧菌与需氧菌之比 1:1 1000:1 1:1 10:1

3、10:1 10:1_ 1986年，将厌氧菌分31属,245个种和亚种，近20年来新的发现增至40多个菌属,300多个菌种和亚钟，而有芽胞厌氧菌只有一个梭菌属,共130个种。 临 床 意 义 由厌氧菌感染在人类感染疾病中占相当大的比例，如脑脓肿，牙周脓肿，腔脓肿80%以上由厌氧菌引起，可以是单独，也可与需氧菌混合感染。 厌氧菌感染的条件 1、组织缺氧或氧化还原电势降低：造成厌氧菌生长繁殖的适宜环境，易遭受厌氧菌感染，原因很多，如局部组织供血障碍，见于血管损伤，肿瘤压迫，烧伤，动脉硬化，组织水肿，梗死，有异物，开放性骨折，各种大型手术。2、机体免疫功能下降：易并发厌氧菌感染，如免疫抑制剂，放疗，化

4、疗；一些慢性疾病导致免疫功能不足或受损易并发厌氧菌感染，如糖尿病患者，慢性肝炎，肾病炎， 老年人，早产儿。3、皮肤粘膜屏障破坏：厌氧菌进入适当的生长繁殖部位，大量繁殖和损伤组织。坏死组织吸收余氧，进一步降低氧化还原电势，更有利于繁殖，产生内、外毒素，侵袭性酶，酸类，气体及其他毒性产物，造成组织进一步损伤、坏死和全身中毒。 4、菌群失调：长期大量使用抗菌药物在厌氧感染中，大部伴有需氧或兼性厌氧菌感染 。厌氧菌感染 感染普遍，以混合感染为主。内源性外源性，无芽胞.芽胞.感染原因 1.局部组织的氧化还原电势（Eh） 2.机体免疫功能 3.机体局部屏障作用破坏感染的临床及细菌学指征： 1.局部气体产生

5、 2.发生在黏膜附近的感染 3.深部外伤或软组织脓肿的脓 4.有特殊的分泌物(硫磺颗粒)及气味(恶臭)和或色素 5.某些抗生素治疗无效的感染 6.最近有流产史，以及胃肠手术后的感染。 7.其它：镜检有菌而培养阴性等厌氧菌的实验室检查临床标本肉眼观察分离培养增菌培养及直接镜检厌氧培养2-7d确定厌养培养需氧培养厌氧培养生长无生长生长兼性厌氧菌专性厌氧菌保存菌种分类鉴定药物敏感试验形态与染色菌落特性生化反应药敏性鉴定气液相色谱标本选择（1）深部伤口或软组织脓肿的脓，特别是伴有恶 臭或含有硫磺颗粒时。（2）可疑为气性坏疽或少见的严重产气或坏死性 感染所取得的坏死组织或病灶清除材料。（3）粘膜部位的感

6、染灶取得的材料。（4）从脑、肺、肝或其他器官的脓肿或从腹腔 内、肛周、隔下或其他部位的脓肿取得的 材料。 （5）无菌区感染灶的吸出液(包括血液、脑脊 液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。（6）人或动物咬伤感染灶取得的材料（7）变黑的或置于紫外线发红色荧光的渗出 物。（8）革兰染色，镜下见到具有厌氧菌独特形态 的材料。（9）可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食物。 厌氧菌是人体许多部位（如皮肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道）正常菌群中的一部分，因此下列材料无需做厌氧培养：（1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。（2）齿龈、咽喉拭子、痰液或气管吸出物、小肠内容物、阴道或宫颈拭子、尿液或导尿液、粪便、洗胃液、皮肤表面或伤口

7、边缘等标本。标本采集采集时注意不被正常菌群污染，尽量避免接触空气不同部位标本采集法 针筒抽取、穿刺术、外科切开等即送即检，避免标本干燥、接触空气和低温保存1.针筒运送法：各种液体标本，简便易行 2.无菌小瓶法：少量脓液运送，加指示剂 3.厌氧袋法：床边接种4.标本充盈法：大量液体标本5.组织块运送法：厌氧罐 检 验 方 法 直接镜检 形态、大小、排列、染色性、有无芽胞、 色素、气味等特。 除血液外，各种标本必须在接种前摇匀后，革兰氏染色。观察细菌的形态和染色性，可估计菌量。肉眼与显微镜结合，作出初步估计。选择培养，进一步检查及时用药。如标本发臭，镜检发现染色不均，形态奇特者常为厌氧菌的表现。为

8、初步鉴定和进一步起指导作用。检 验 方 法之分离培养1.初代培养：比较困难，不仅要有一个与人体内感染部位相似的无氧环境，而且还要选择适当的培养基。1）培养基：新鲜、预还原 非选择性培养基：GAM(血、 维生素、氯化血红素等 )选择培养基 ：KVLB、EYA、BBE、THIO2）标本接种：固体和液体培养基同时接种3）培养方法：厌氧罐培养法、厌氧气袋培养法、厌氧培养箱培养法 4）结果观察 2.次代培养和厌氧菌的确定 3.厌氧菌培养失误的原因:采集运送 培养基 厌氧环境 时间等因素 厌氧罐法以物理或化学方法造成无氧环境美蓝指示剂（有氧蓝色）刃天青指示剂（有氧红色）抽气换气法： 10%H2、10%CO

9、2、80%N2、钯粒 冷触媒法： 产气袋、钯粒、美蓝钯粒硼氢化钾、碳酸氢钠、枸橼酸药片 CO2+H2H2O O2 气袋法： 原理同上冷触媒法简便 厌氧手套箱： 设备自动 其他：OxyplatesTM（氧净）厌氧培养皿可反复打开，Oxyrase酶系统能使培养基中O2去除，并产生CO2。鉴定试验： 形态与染色： 用24h内幼龄菌，多染色性，多形性 生化试验：糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验等 抗生素敏感试验：灭滴灵（厌氧菌S）、卡那霉素（梭杆S）、万古霉素等聚茴香脑磺酸钠（SPS）敏感试验：厌氧消化链S气液相色谱技术（GLC）厌氧菌产生大量的有机酸（挥发性和非挥发性脂肪酸），过柱分析

10、定性定量DNA G+C mol% 值差越大，亲缘关系越远 菌落性状：色素、溶血、荧光等 （1） 色素：产黑色素普鲁沃菌培养210天可产生黑褐色或黑色色素，龋齿放线菌培养34天后产生粉红色色素，奈氏放线菌延长培养时间可产生黄褐色色素。 （2） 溶血：产气荚膜梭菌在新鲜血平板上可形成双溶血圈，但同种的菌不同株则往往产生溶血性的差异，各细菌产生的溶血毒素不同，对不同动物红细胞溶解亦有差异。 （3） 荧光：产黑色素普鲁沃菌，菌落在紫外线照射下，发出砖红色荧光，梭杆菌常发生黄绿色荧光，艰难杆菌发生绿色荧光。 几种常用的鉴定试验（1）灭滴灵纸片周围出现抑菌环说明有厌氧菌生长（绝大多数专性厌氧菌对灭滴灵敏感

11、，兼性厌氧菌耐药）。（2）耐氧试验：接种平板（需氧厌氧各放一块）及巧克力平板（置CO2条件下）。（3）革兰染色：根据菌落和菌体形态、染色特性可初步鉴定。（4）抗生素敏感性鉴定：平板上分区划线接种，第一划线区贴多粘菌素（10g/片）、卡那霉素（1000g/片）和万古霉素（5g/片）。厌氧菌纯培养抑菌环直径=10mm为敏感。药物敏感试验考虑做体外药敏试验的临床情况：明确厌氧菌引起的严重感染、已确证厌氧菌感染而经验用无效、需长期用药的厌氧菌感染。方法 培养基 接种浓度 孵育时间 优点琼脂稀释法 布氏血琼脂 105细胞点 48H 可同时测多个菌株肉汤稀释法 布氏心老浸液 106CFUML 48H 经济

12、，可品化商 E试验 布氏血琼脂 0.5麦氏比浊度 2448H MIC精确内酰胺酶 琼脂培养基 单个菌落 35min 经济快速检测对青 霉素G和AMP的耐药 厌氧菌直接镜检初步鉴别 菌名 革兰染色 形态及其他特征 破伤风杆菌 G+b 细长、梭形或鼓状，有芽胞、周鞭毛 产气荚膜梭菌 G+b 粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞， 有荚膜 放线菌 G+b 分支呈棒状、X、Y、V或栅状，脓汁 中的黄色颗粒有琥珀酸气味产黑色素类杆菌 G-b 多形性，长短不一，标本有恶臭， 琥珀味，紫外线照射发红色荧光韦荣球菌 G-c 极小的革兰阴性球菌消化链球菌 G+c 革兰阳性呈现链状的小球菌厌氧菌种属梭状芽孢杆菌属（破伤

13、风、产气荚膜、肉毒、艰难）革兰阴性无芽孢厌氧杆菌（类杆菌、普雷沃菌、紫单胞菌、梭杆菌）革兰阳性无芽孢厌氧杆菌（丙酸杆菌、优杆菌、乳杆菌、双歧杆菌）厌氧性球菌（消化球菌、消化链球菌、韦荣球菌）梭状芽孢杆菌属(梭菌属)破伤风梭菌产气荚膜梭菌肉毒梭菌艰难梭菌 厌氧芽胞杆菌只有一个属(梭菌属)，130个种，G但在陈旧培养物中G，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体横径，位于菌体中央、极端或次端，使菌体膨大呈梭状而故名。本菌属在自然界分布广泛，常存在于土壤、人和动物肠道及腐败物中，多数为腐物寄生菌。梭状芽胞杆菌的芽胞形式在自然界长期存活。其中不少菌可用于生物工程技术，发酵商业和工业所需的有机溶剂、酸类，少数

14、为致病菌，能分泌外毒素和侵袭性酶类，可使人和动物致病。一、破伤风梭菌 (一)生物学性状 1.形态染色: G+b 芽胞圆形比菌体大位于菌体顶端呈鼓槌状 2.培养特性: 专性厌氧菌羽毛状菌落，迁徙生长， 有腐败恶臭。 3.生化反因：不发酵糖类，产H2S。 4.抵抗力：芽胞耐12120min或干热1501h 对P敏感 5.临床意义：致病因素-痉挛毒素(可被抗毒素中和) 临床症状牙关紧闭 角弓反张等 100万人，20%死亡 (二)微生物学检查 典型症状 直接涂片镜检 （二） 微生物检验 破伤风的临床症状比较典型，一般不需要实验室检查。如果需要试验结果， 可按下列方法进行 1. 直接涂片从病灶处取脓汁或

15、坏死组织，直接涂片G染色，G鼓槌状杆菌。 破伤风梭菌破伤风梭菌芽胞染色 2. 厌氧培养 可疑材料接种疱肉培养基75 85水浴加热30min，杀灭其它杂菌，芽胞存活，35 37培养2 4天，呈薄膜状迁徙生长，边缘扩散，常为平板的1/2 2/3，要获得纯培养。有时需2 3次转种。加硫酸新霉素可抑制其它厌氧菌的生长。 3.毒力试验 有毒力试验和毒力保护试验。前者是在小白鼠尾根部皮下0.1 0.25ml培养滤液，阳性出现尾部僵直竖起、后腿强直或全身肌肉痉挛至死亡；后者是将培养液与破伤风抗毒素混合注射不发病。 4.鉴定 一般取伤口分泌物作涂片镜检，其典型鼓槌状菌体有鉴定意义。必要时进行细菌培养，并用动物

16、保护试验作最后鉴定。有条件时，可用气液相色谱检测其主要代谢产物协助早期快速诊断。二、产气荚膜梭菌简 介 产气荚膜梭菌是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌。因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，造成气肿，继而影响血液供应，造成组织大块坏死(坏疽)，加上本菌在有机体内能形成荚膜，故名产气荚膜梭状杆菌。 此菌的致病条件与破伤风芽胞梭菌相同，主要是大面积创伤、局部供血不足。此时组织缺氧坏死，氧化还原电势下降，芽胞发芽繁殖，产生毒素和侵袭性酶，引起感染致病。所致疾病主要是气性坏疽，某些型也可引起食物中毒和坏死性肠炎。(一)生物学性状 1.形态染色：G+粗短大b，两端钝圆，芽胞椭 形位于菌体中央

17、或次极端，直径 不大于菌体，有荚膜 2.培养特性：繁殖迅速 血平上双层溶血环 Nagler反应 “汹涌发酵” 3.生化反应：发酵糖类，产酸产气，产H2S，卵磷脂酶阳性。 4.临床意义及鉴定依据： G+ B，WBC少 外毒素和侵袭性酶类引起气性坏疽临 床 表 现水肿、皮下捻发音 （三） 微生物检验 1 检验程序包括直接涂片镜检、厌氧培养、然后挑取可疑菌落镜检、汹涌发酵试验、生化反应、动物试验等。 2 标本的采集一般取创伤深部的分泌物、穿刺物、坏死组织块,菌血症时期的血液，可疑食物，其中坏死组织应研磨成悬液。 3 标本直接检查G粗大杆菌，伴有其它杂菌，白细胞较少形态不规则，是气性坏疽直接涂片的特点

18、，对早期诊断及时防治。1 分离培养与鉴定（1） 厌氧培养本菌可耐受耐低氧，生长迅速， 容易分离。（2） 鉴定 1） 形态特征和芽胞、荚膜 2） 菌落特征和汹涌发酵 3） Nagler试验 4） 动物试验，培养物接种动物后腿肌肉中产生典型 5） 挥发性代谢产物的测定：丁酸、乙酸 产气荚膜梭菌 产气荚膜梭菌四、肉毒梭菌1.形态染色：G+大杆菌 芽胞椭圆形位于菌体次极端，比菌体粗，呈网球拍状2.培养特性：不规则、灰白色、半透明菌落3.生化反应：发酵部分糖类，产H2S，脂酶阳性4.临床意义及鉴定依据：肉毒病 检查毒素 肉毒毒素外毒素，毒性最强 嗜神经性 5. 微生物检验 该菌引起食物中毒，诊断主要检出

19、毒素。因肉毒梭菌本身不致病，所以检测主要是毒素测检，再同时作细菌培养，标本取可疑剩余食物、呕吐物或胃冲洗液。用免疫学方法检测毒素及分型。附加细菌培养及形态学检查。肉毒芽胞梭菌 肉毒梭菌五、艰难梭菌革兰阳性粗长杆，芽胞为卵、圆形或长方形，次极端。CCFA平板上：表面粗糙、不整齐、黄色菌落发酵葡萄糖，产不H2S伪膜性肠炎：毒素A、B六、革兰阴性无芽胞杆菌类杆菌属（脆弱拟杆菌）普雷沃菌属（产黑色素普雷沃菌）紫（卟啉）单胞菌属梭杆菌属拟杆菌26个种，感染标本中最常见的厌氧菌（脆弱类杆菌）G-B、不易着色，有荚膜，20%胆汁可促进生长（15种），发酵多种糖类普雷沃菌20个种，产黑色素8种，不产12种产黑

20、色素普雷沃菌G-B或球杆、不易着色，多形性，无荚膜，20%胆汁敏感，发酵多种糖类产黑色素普雷沃菌紫（卟啉）单胞菌12个种，与人类有关主要3个种（口腔疾病）不解糖紫单胞菌G-B短杆状或球杆状，染色不均梭杆菌属16个种，人类来源12种具核梭杆菌G-梭状，多数不发酵糖类，20%胆汁不生长七、革兰阳性无芽胞杆菌丙酸杆菌属（多见）优杆菌属（次之）乳杆菌属双歧杆菌属 蛛网菌属放线菌属丙酸杆菌属8个种，与人类感染有关的主要有3种：痤疮、贪婪、颗粒丙酸杆菌G+B，多形态，触酶阳性优杆菌属45个种，17种与临床有关，迟钝优杆菌及粘液优杆菌多见G+B，多形态，触酶阳性，胆汁促进生长，不酵任何糖类乳杆菌属44个种，个亚种，10种与人类密切相关，嗜酸乳杆菌最常见可专性厌氧、兼性或微需氧，PH要求较低些（5.5-6.2）八、厌氧球菌消化球菌（黑色消化