临床生物化学检验实验：实验一 血清总蛋白测定及其校准曲线制作

1、实验一 血清总蛋白测定及其校准曲线制作 【实验目的】1掌握血清总蛋白测定原理和方法2掌握校准曲线的制作方法3. 在实验过程中掌握实验基本技能 【原理】1血清总蛋白测定 血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。 【原理】2血清总蛋白校准曲线制作校准曲线可提供实际检测

2、系统中浓度和吸光度的已知关系，从而计算出标本的测定浓度：（1）直接从校准曲线上查得；（2）从回归方程中计算；从回归方程也可先预先计算出一系列吸光度对应的浓度并制成一个吸光度和浓度关系表，标本测定后直接可查出浓度；（3）若截距为零（此方法理论上应当是零），则可求得校准系数K，标本吸光度乘上K即为浓度。Uc=Au/As*Cs , 如果K=Cs/As ，则Uc=Au*K。从血清总蛋白的剂量反应曲线已知其线性上限可达140g/L，因而要求在此线性范围内制作校准曲线。 1. 6.0mol/L NaOH溶液 称取NaOH240 g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）约800ml中，待冷却后定容

3、至1L，置有盖塑料瓶中，室温保存。2. 双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶（CuSO45H2O）3g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）500ml中，加入酒石酸钾钠9g和KI 5g，待完全溶解后，边搅拌边加入6mol/LNaOH 100ml，然后用蒸馏水定容至1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若储存瓶中有黑色沉淀出现或试剂在波长540nm的吸光度不在0.0950.105之间，都需要重新配制。试剂配制过程中加入的顺序不能颠倒，否则可能会产生难以溶解的氢氧化铜沉淀。双缩脲空白试剂，即试剂中不含硫酸铜。3. 蛋白质标准液 标准液或者校准品浓度临床上使用一般在60-70g/L，本次

4、实验仅为制作标准曲线而采用140g/L的蛋白标准液。4. 722分光光度计 【试剂】 【操作】(一)、手工操作： 由于只有在标本存在颜色干扰因素时，如明显的溶血，才进行标本空白测定，且标准空白可忽略不计，因此本次实验不测定“标准空白管”和“标本空白管” 。 1.双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤 （表一） 37水浴10min，在波长540nm处比色，以空白管B调零，测定各管吸光度。 加入物(ml)BSU血清0.10蛋白标准液0.10蒸馏水0.10双缩脲试剂5.05.05.0 10ml吸管使用器材 移液器移液器移液器 【操作】(一)、系列标准浓度配制及校正曲线测定操作（表二）（包括表一测定）第26各

5、管号平行做2管取均值，37水浴10min，在波长540nm处比色，以第1管调吸光度零点，测定各管吸光度。 10ml吸管使用器材微量进样器微量进样器管号12232425262U140g/L蛋白标准液（ul）020406080100待测100去离子水（ul）1008060402000双缩脲试剂（ml）5.05.05.05.05.05.05.0相当于蛋白质（g/L）028.056.084.0112.0140.0？ 【计算】 用3种方法得出标本总蛋白浓度： （1）在坐标纸上作图，横坐标为浓度，纵坐标为吸光度，从标准曲线上直接查得结果。作图要规范，标明标题、浓度单位、温度、比色计编号、型号、日期以及制作

6、人等。（2）以回归方程，（用Excel软件，计算a，b，得出方程y=a+bx，相关系数r，y吸光度、x浓度 ）计算得到结果。（3）以最接近待测管A的标准管A和浓度作为标准来计算，计算公式为血清总蛋白（g/L）AU/As*Cs 【参考范围】 1.8-6.8 mmol/L。 【参考区间】 成人走动后：6483g/L静卧时：6078g/L 【检测影响因素及注意事项】1、双缩脲试剂各成分的作用： 酒石酸钾钠 与Cu2+生成可溶性酒石酸铜，防止Cu（OH）2沉淀； KI 抗氧化，防止酒石酸铜被还原。2、干扰因素： 严重的脂浊、黄疸、溶血对双缩脲反应有干扰，手工法可用标本空白减去，分析仪法可以采用双波长、

7、两点终点法来消除来自标本的干扰。3、反应时间和灵敏度： 双缩脲反应反应时间较长，室温反应时间往往要30分钟才达到平衡，37也需5-10分钟。灵敏度较低，其检测低限为1g/L左右，因此蛋白质含量比较低的体液如脑脊液、尿液和蛋白质含量较低的胸腹水，不宜采用双缩脲法（CSF:0.150.45g/L）。 【检测影响因素及注意事项】4.校准曲线的制作： 以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，画经过各点的一条直线段。作图要规范，标明标题、浓度单位、温度、比色计编号、型号、日期以及制作人等。 掌握刻度吸量管的使用生化实验基本操作 奥氏吸量管 移液管 刻度吸量管 奥氏吸量管 规格：0.510ml 特点 只有一个刻度

8、 放液最后须吹出残留在管尖的液体 准确度最高 用途：量取粘度较大的液体 移液管 规格：1100ml 特点 只有一个刻度 放液最后不吹出残留在管尖的液体，停靠5s 用途：作为化学容量分析定量稀释之用 刻度吸量管 规格：0.110ml 特点 用途：量取10ml以下的任意体积液体之用分到尖端者和不到尖端者两种所标刻度有自上而下或自下而上的两种刻度到尖端吸量管上标有“吹”或“快”的吹 吸量管的选用原则 量取整数量液体时，可选用奥氏吸量管 量取液体体积较大时可用移液管 选用与取液量最近并大于最大取液量的吸量管如几个试管需加入不同量的同一种液体时， 要根据加入液体的量酌情选用 尽量选用卸量法来量取液体 加样： 加样枪、微量进样器、刻度吸管的正确使用与注意事项，确保加样的准确有效。加试剂：选择合适的刻度吸管，自如地控制吸管的流量，正确观察刻度，注意加入方式。混匀：选择混匀的方式或旋涡混匀器，混匀应快速、彻底、有效。保温反应：恒温，温度选择、掌握时间，防止污染。要注意水浴箱的水位应高于反应液面，靠水浴后缘的要防止水浴箱盖的冷凝水滴落至反