临床生物化学检验实验：实验五 碱性磷酸酶测定2015

1、1实 验 五血清碱性磷酸酶测定及线性期观察 2实验目的 掌握：色素原底物测定ALP的原理和优点熟悉：熟悉定时法和连续监测法测定酶活性不同摩尔吸光系数的测定方法测定ALP的临床意义 了解：定时法的线性观察 3 血清碱性磷酸酶测定一、概述 ALP为碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是一组底物特异性较低，在碱性条件下能水解磷酸单酯化合物的酶。需要镁和锰离子为激活剂。广泛分布于机体各器官组织，在肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等组织含量较高。血清中的ALP主要来源于肝脏，小部分来源于骨骼。4碱性磷酸酶同工酶分为四型：肠型（IAP）、生殖细胞型（GCAP）、胎盘型（PALP）和非特异

2、组织型（TUAP）。 ALP确切的生理作用目前仍不十分清楚，一般认为骨中ALP和骨的钙化作用密切相关，成骨细胞中的ALP作用产生磷酸，与钙生成磷酸钙沉积于骨中。ALP还广泛存在于肝细胞血窦侧和胆小管膜上、肾近侧曲管刷状缘和小肠粘膜的微绒毛，据此推测它可能还与物质的吸收和运转过程有关。5ALP变化与年龄密切相关，新生儿ALP略高于成年人，以后逐渐增高，在1-5岁有一次高峰，可达成年人上限2.5-5倍，以后下降，到儿童身长增高期又再次上升，第二高峰在10-15岁之间，可达成人上限4-5倍。20岁后降至成年人值，到老年期又轻度升高。孕妇血清ALP在妊娠3个月即开始升高，9个月可达峰值，约为正常值的2

3、倍，ALP升高可维持到分娩后1个月，升高的ALP来自胎盘，和胚泡壁的细胞滋养层的发育程度直接相关。高脂餐后，血清ALP活性升高。 6二、测定方法因底物不同，测定方法很多。具有代表性的方法有：（1）以布氏（Bodansky）法为代表：-甘油磷酸钠做底物经ALP作用后产生磷酸根，通过定量磷来测定。（2）以金-阿（King-Armstrong）法为代表：磷酸苯二钠做底物经ALP作用后产生酚，通过定量酚来测定。（3）以皮-劳（Bessey-Lowery-Brock）法为代表：人工合成底物磷酸对硝基酚二钠盐（PNPP）做底物，经ALP作用后产生对硝基酚在碱性的测定条件下呈黄色而可以连续监测。 7实验原理

4、 PNP在碱性环境下呈黄色（405nm），在400410nm处监测吸光度变化速率，来计算ALP活性。AMP: 2-甲基-2-氨基-1丙醇定时法：用氢氧化钠终止反应。连续监测法：利用连续监测吸光度增高速率（A/min）与ALP活性成正比。求出ALP的活性。（自动化分析）ALP测定的反应式为：8试剂与器材 1.试剂组成（1）试剂（R1）： 2-甲基-2-氨基-1丙醇 （AMP） 缓冲液1.00mol/L、 MgCl2 0.5mmol/L（2）试剂（R2）：4-NPP 100mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L（3）4-NP标准品：2mmol/L（4）0.2mol/LNaOH 若作单试剂法，

5、可将试剂4份与试剂1份临用前混合成工作液。2.生化分析仪测定条件 温度370.1；光径1.00.01mm；波长4051nm；带宽2nm。91、标本检测：在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37水浴预温5min后使用；具体操作按下表进行。加入物(ml) 测定管（1号血清）标准管空白管血清 0.02标准液0.02蒸馏水0.02基质缓冲液 2.02.0 2.0混匀后，置37准确保温10min0.2molNaOH 2.0 2.0 2.0 室温放置5min，在波长405nm处以空白管调零，读取各管吸光 度。手工操作步骤 102、反应线性期观察加入物(ml) U1U6（2号血清）SB血清 0.02标准液0

6、.02蒸馏水0.02基质缓冲液 2.02.0 2.037保温 2.5、5、7.5、 10、12.5、15 min 10min 10min0.2molNaOH 2.0 2.0 2.0室温放置5min，在波长405nm处以空白管调零，读取各管吸光 度。11（1）用标准管求出实际计算 122000umol/L=2mmol/L，10分钟理论4-硝基酚（PNP）：18 500（405nm）固定时间法连续监测法（2）计算结果（单位定义：1分钟分解1umol底物的酶活性）13（3）观察反应线性期 制图：在方格纸上绘制线性图,横坐标为时间t， 纵坐标为吸光度A，观察线性。 代入公式计算：14 血清ALP:成人

7、40150U/L 。 ALP测定结果与所用方法种类和测定温度密切相关，就是同一底物，因缓冲液不同，其结果可有2-3倍差异，目前国内应用较多的方法中以磷酸对硝基酚为底物，ALP在不同年龄人群中有较大差异。参考范围 151、 ALP早在本世纪30年代就用于临床，是临床医师非常熟悉的酶之一，在70年代前ALP是世界上临床测定次数最多的酶，主要用于骨骼和肝胆系统疾病的诊断和临床鉴别诊断。临床应用 16 2、ALP和骨化过程密切相关，很多骨骼疾病如变形性骨炎（Paget病）、副甲状旁腺功能亢进、佝偻病、软骨症、原发性和继发性骨肿瘤、骨折和肢端肥大症的患者血中ALP都可升高，尤其是变形性骨炎，增高非常明显

8、，可达正常上限值的50倍。此病在我国少见，我国常用于早期诊断佝偻病和软骨病，ALP升高早于血钙、磷变化以及X线检查，是一个很灵敏的诊断指标，但应注意骨质疏松患者血中ALP一般都在正常范围内。173、目前ALP测定主要用于黄疸的鉴别诊断，阻塞性黄疸时血清ALP常早期明显升高，甚至可达正常上限值的10-15倍，在完全阻塞性黄疸病例中，80病例血中ALP超过正常上限5倍。一般而言血清ALP持续低于正常上限值2倍时，阻塞性黄疸可能性较小，肝性黄疸时ALP轻度升高，一般不超过正常上限的2-3倍，约有半数原发性肝癌血中ALP升高，升高程度也常较明显，甚至可达正常上限值的15-20倍。如在无黄疸肝脏疾病人血

9、中发现有ALP升高应警惕有无肝癌可能。184、ALP升高还可见于其它疾病，如急慢性胰腺炎、慢性肾衰、肠梗塞、肺梗塞等疾病，但无太大临床价值，某些药物如孕激素、雌激素、胎盘白蛋白等也可引起血中ALP升高。5、血ALP下降见于甲状腺功能低下、恶性贫血和遗传性碱性磷酸酶减少症等 。191、宜用血清标本测定。草酸盐、枸橼酸盐、EDTA等可抑制酶活性。血清置室温或4冰箱酶活性可轻度升高。2、各类分析仪的波长设置有可能不同，401nm、405nm、410nm等都可使用。但是若测定波长不是405nm，则4-NP的摩尔消光系数不同，F值应随之改变。注意事项203、PNPP的纯度对测定结果影响很大。合格的PNP

10、P所含杂质应尽量低，要求：游离4-NP小于0.03%，无机磷小于1%。 4、关于ALP测定的缓冲液分为三类：惰性型：如碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液抑制型：如甘氨酸缓冲液活性型：如AMP、Tris和DEA缓冲液。根据酶活性测定最适条件的要求，尽量选择活性缓冲液，AMP缓冲液虽然活性不如DEA缓冲液，但因具有杂质含量少，温度依数性小等优点而被IFCC和我国检验学会的推荐方法采用。若用不同缓冲液测定ALP时，其参考值不同。 215、底物有一定自身水解作用，酶活性计算时应扣除试剂空白变化速率。试剂空白增加说明底物有自身水解作用，为保证足够的底物浓度需设置试剂空白吸光度限额。22 1、布氏法和金-阿法因操作烦琐，不能连续监测，试剂稳定性差，受产物抑制明显等缺点，已很少使用。皮-劳法根据缓冲液不同又分为多种方法。其中以磷酸酰基的受体2-甲基-2