2-t淋巴细胞转化实验

1、2-t淋巴细胞转化实验2-t淋巴细胞转化实验第1页T淋巴细胞增殖分化、DNA等大分 子物质合成增加淋巴母细胞刺激物PHA体积变大胞浆增多、空泡核仁显著核染色质疏松基础原理有丝分裂同位素法MTT法形态法2-t淋巴细胞转化实验第2页检测方法： 形态学计数法 MTT法 同位素法2-t淋巴细胞转化实验第3页试验目标试验原理试剂与器材操作步骤结果判断注意事项试验讨论教学内容：2-t淋巴细胞转化实验第4页一、形态学计数法2-t淋巴细胞转化实验第5页试验目标1.掌握T淋巴细胞转化试验原理。2.熟悉淋巴母细胞形态特征及判定方法。2-t淋巴细胞转化实验第6页 T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细胞形态和代谢

2、发生改变，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。 试验原理2-t淋巴细胞转化实验第7页1. RPMIl640 培养液 。包含： 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素 100ug/m1，用无菌3% NaHCO3 调 pH 至 7.27.4。2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清RPMI 培养液稀释至5001000g/ml。 试剂与器材 2-t淋巴细胞转化实验第8页3. 姬姆萨染液。4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。5器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。试剂与器材 2-t淋

3、巴细胞转化实验第9页5%CO2 37 72h1500rpm 离心10min染色镜检观察细胞形态PHA无PHA外周血0.2ml吸收白细胞层涂片操作步骤2-t淋巴细胞转化实验第10页 1取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml )0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、5%CO2培养箱内孵育72h，期间天天旋转摇匀一次。2培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管中，1500rpm 离心10min。操作步骤2-t淋巴细胞转化实验第11页 3弃上清，吸收白细胞层制片，自然干燥。 4甲醇固定12min后，姬姆萨染色15

4、20min，水洗，干燥。 5油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞形态改变，计算淋巴细胞转化率。操作步骤2-t淋巴细胞转化实验第12页2-t淋巴细胞转化实验第13页淋巴细胞标志及功效检测 龚道科 .4未转化淋巴细胞淋巴母细胞结果判断2-t淋巴细胞转化实验第14页 未转化和转化淋巴细胞形态特征转化淋巴细胞未转化淋巴细胞淋巴母细胞 过渡型细胞大小(直径m)1220121668核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清楚、14个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无2-t淋巴细胞转化实验第15页四、结果观察 能够见到以

5、下几个类型细胞(1) 成熟小淋巴细胞：与未经培养小淋巴细胞一样为 6 -8 um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆百分比大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 2-t淋巴细胞转化实验第16页淋巴细胞标志及功效检测 龚道科 .42-t淋巴细胞转化实验第17页(2) 淋巴母细胞： 细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。2-t淋巴细胞转化实验第18页2-t淋巴细胞转化实验第19页淋巴细胞标志及功效检测 龚道科 .42-t淋巴细胞转化实验第20页(3) 过渡型淋巴细胞： 比小淋巴细胞大，约 l0 - 20 u m ，核染色致

6、密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞判别关键点。2-t淋巴细胞转化实验第21页结果判断2-t淋巴细胞转化实验第22页2-t淋巴细胞转化实验第23页(4) 其它细胞： 如中性粒细胞在培养 72h 后，绝大个别衰变或死亡，呈碎片。 2-t淋巴细胞转化实验第24页2 淋巴细胞转化率计算：按上述分类检验推片头、体、尾三个别，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按以下公式计算转化率：2-t淋巴细胞转化实验第25页2-t淋巴细胞转化实验第26页在正常情况下， PHA 诱导淋巴细胞转化率为 60 一 80 ，如为 50 一 60

7、 则偏低， 50 以下则为降低。2-t淋巴细胞转化实验第27页 1 培养基成份对转化率影响较大，注意其使用期。 2 小牛血清用前需灭活。 3 培养时要确保有足够气体，确保无菌。 4 PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化反应剂量普通 10m1，培养瓶内液体总量不要超出 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应先测定。 注意事项2-t淋巴细胞转化实验第28页二、MTT比色法2-t淋巴细胞转化实验第29页试验目标 熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验原理及其操作方法。 2-t淋巴细胞转化实验第30页一、原理 T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性对应升高，四

8、甲基噻唑蓝（MTT）作为其底物参加反应，被催化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸异丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢形成量与细胞增殖活化程度呈正相关。 试验原理2-t淋巴细胞转化实验第31页1. RPMIl640 培养液 。2. 植物血凝素（PHA）。3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。 试剂与器材 2-t淋巴细胞转化实验第32页5%CO2 37 68h1500rpm 离心10min酶联免疫检测仪A570nm盐酸异丙醇 100l/孔 操作步骤分离外周血单个核细胞1106/ ml 培养板

9、（含PHA） 培养板 （无PHA）加入MTT 20l/孔 4h100l/孔 2-t淋巴细胞转化实验第33页 1.先采取密度梯度离心法分离外周血单个核细 胞，并用含10%小牛血清RPMI 1640培养液调 整细胞浓度至1106/ ml。2将细胞悬液加入96孔培养板中，100l/孔， 每个样品三个复孔，并设对应对照孔。试验孔 加含50g/mlPHA(终浓度5g/ml) 100l， 对照孔加不含PHA1640培养液100l， 3混匀后置37C、5% CO2培养箱内培养68h。操作步骤2-t淋巴细胞转化实验第34页4将培养板1500 rpm离心10min，吸弃上清 液，每孔加MTT20l，混匀，继续培

10、养4h 后，每孔加100l盐酸异丙醇，低速振荡10 min。5充分溶解后，采取酶联免疫检测仪双波长 570nm/630nm测定各孔A值，测定值为A570nm 减去A630nm最终止果。 操作步骤2-t淋巴细胞转化实验第35页结果判断以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：2-t淋巴细胞转化实验第36页1.试验过程注意无菌操作。因为本试验需要培养3 天才能观察结果。所以，在操作时应防止细菌 污染造成试验失败。2淋巴细胞要新鲜制备, 普通在采血后2h内进行 试验。操作时动作要轻柔、快速，以免细胞损 伤而影响试验结果。注意事项2-t淋巴细胞转化实验第37页3加入MTT比色法盐酸异丙醇后要在30 mi

11、n内进 行测定，若要求时间内来不及测定，可将未加 盐酸异丙醇培养板置4C保留。测定前取 出，室温静置10min后再加盐酸异丙醇。注意事项2-t淋巴细胞转化实验第38页1.试讨论MTT比色法淋巴细胞转化试验优缺点？2. MTT比色法轻易因细菌污染造成试验失败，应采取哪些办法可降低试验误差，使结果可信？试验讨论2-t淋巴细胞转化实验第39页三、3H-TdR掺入法2-t淋巴细胞转化实验第40页试验目标 熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试验原理及其操作方法。2-t淋巴细胞转化实验第41页一、原理 T淋巴细胞受PHA或特异性抗原刺激后，发生淋巴母细胞转化，此过程中DNA合成显著增加。此时把氚标识胸

12、腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside，3H-TdR）加入细胞培养液中，可被细胞摄取而掺入到新合成DNA中。 测定淋巴细胞内放射量，即可判定淋巴细胞转化程度。 试验原理2-t淋巴细胞转化实验第42页1. RPMIl640 培养液 。2. 植物血凝素（PHA）。3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。4. 3H-TdR工作液 以生理盐水稀释成100ci/ml，于4 保留备用。5闪烁液 避光保留。6器材 96孔细胞培养板、CO2培养箱、49型玻璃纤维滤 纸、多头细胞搜集器、-液体闪烁计数仪、闪烁测量 杯。试剂与器材 2-t淋巴细胞转化实验第43页5%CO2 37 56h液体闪烁器计数cpm搜集培养细胞于滤膜上操作步骤分离外周血单个核细胞1106/ ml 培养板（含PHA） 培养板 （无PHA）加入3H-TdR 10l/孔 100l/孔 5%CO2 37 16h2-t淋巴细胞转化实验第44页结果判断以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程