蛋白质纯化技术

1、蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术第1页分子生物学圣经分子克隆试验指南蛋白质纯化技术第2页为何要纯化蛋白质？理论意义：深入研究某种蛋白质功效以及作用机制，如信号通路中蛋白质应用价值蛋白质工程 医药、工业、科研 作为药品靶点蛋白质是生命功效执行者蛋白质纯化技术第3页蛋白质工程中进行蛋白质纯化必要性首先，需要单一蛋白质作为试验材料，研究其结构与功效；其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一蛋白质作为原材料；最终，为了生产性能更优良蛋白质，需要对设计改造过蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品。蛋白质纯化技术第4页本章概要蛋白质纯化方法蛋白质纯化标准纯化步骤蛋白质判定蛋白质纯化技术第5页一、蛋白纯化方法蛋白质

2、纯化依据： 不一样蛋白质，理化性质不一样。理化性质不一样原因： 氨基酸数目和序列不一样。蛋白质纯化技术第6页1.与蛋白质分离纯化相关理化特征分子大小分子形状带电特征溶解特征与配体特异性结合不一样吸附性质变性和复性蛋白质纯化技术第7页1.1分子大小蛋白质分子大小主要取决于： 蛋白质肽链数目 每条肽链氨基酸残基数目。几百百万 Da常见方法透析超滤凝胶过滤离心蛋白质纯化技术第8页 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开方法。蛋白质纯化技术第9页蛋白质纯化技术第10页 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。蛋白质纯化技术第1

3、1页 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液目标。蛋白质纯化技术第12页凝胶过滤 是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离技术，又称为分子筛层析或排阻层析。 蛋白质纯化技术第13页蛋白质纯化技术第14页超速离心离心（centrifugation）：利用机械快速旋转所产生离心力，将不一样密度物质分离开来方法。 超速离心法 (ultracentrifugation)：60万 g ， 6万8万 r/min。可用来测定蛋白质分子量。蛋白质纯化技术第15页超速离心蛋白质纯化技术第16页1.2分子形状形状蛋白质在离心经过溶液时，或经过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝

4、胶中时，都会受到分子形状影响。方法梯度离心电泳蛋白质纯化技术第17页1.3电荷原理蛋白质净电荷与蛋白质等电点pI以及环境pH值相关（pHpI，）方法电泳离子交换层析蛋白质纯化技术第18页蛋白质纯化技术第19页1.4溶解度原理蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不一样，所以在溶剂中溶解度不一样。经过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子凝聚进而形成沉淀。方法：沉淀法盐析法（eg. 硫酸铵）有机溶剂沉淀法（eg. 丙酮）等电点沉淀法蛋白质纯化技术第20页蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为盐析。盐析原理：高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面水化膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而引发蛋白

5、质沉淀，但通常不会引发蛋白质变性。盐析法蛋白质纯化技术第21页1.5配体特异性结合原理生物大分子一些特定结构区域能够特异性识别其它分子并可逆结合，生物分子间这种结合能力称为亲和力。方法将含有亲和力两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。分类免疫亲和层析生物亲和层析金属螯合亲和层析蛋白质纯化技术第22页1.6吸附性质原理 蛋白质可吸附在不一样材料表面，如金属、陶瓷、塑料等。方法疏水层析蛋白质纯化技术第23页1.7变性和复性原理变性：蛋白质在一定理化条件下会失去原有空间结构、生物学功效及个别理化特征。复性：当变性条件去除后恢复原有空间结构及生物学功

6、效。方法如，利用尿素变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表示蛋白蛋白质纯化技术第24页2. 分离方法在试验操作上，分为：沉淀法离心法电泳法超滤法相分配法层析法蛋白质纯化技术第25页蛋白质纯化技术第26页*不可能有一套统一方法适合用于分离纯化全部蛋白质，*但每一个蛋白质可能都有一套适合分离纯化程序，*而且所用主要技术伎俩都基础相同。Note蛋白质纯化技术第27页二、蛋白质纯化总标准和纯化步骤总标准以合理效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞全部其它成份，尤其是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。蛋白质纯化技术第28页二、蛋白质纯化总标准和纯化步骤步骤选择试验材料，试验材料预处

7、理蛋白质提取蛋白质粗分级蛋白质细分级蛋白质判定 蛋白质纯化技术第29页蛋白质纯化前期准备 关于蛋白质咱们已知什么？最好起源？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白量？怎样进行判定？纯化时间长短？最终花费？纯化方案？蛋白质纯化技术第30页1、选择试验材料及预处理选择试验材料物种选择组织选择试验材料预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤：自来水蒸馏水提取缓冲液材料破碎：蛋白质纯化技术第31页材料破碎机械剪碎研磨重复冻融法超声破碎法高压匀浆法酶解法蛋白质纯化技术第32页2、蛋白质提取提取分离标准尽可能多地提取目标蛋白，同时防止活性丢失（温度过高、 pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等原因）选择适当pH、选择适

8、当离子强度蛋白质纯化技术第33页2、蛋白质提取提取液成份确实定pH 缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬酸-柠檬酸钠离子：动物 NaCl, 植物KCl还原剂:DTT蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF金属离子螯合剂: EDTA, EGTA去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20甘油温度 04蛋白质纯化技术第34页3、蛋白质粗分级（粗提）使用蛋白质提取缓冲液提取试验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质浓度往往较低，采取一些简单方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量杂质。常见试验技术：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析

9、、超滤蛋白质纯化技术第35页4、蛋白质细分级粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要依据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电情况深入纯化。常见试验技术：层析蛋白质纯化技术第36页4.1. 层析（ chromatography ）固定相：凝胶流动相：缓冲液原理：蛋白质纯化技术第37页凝胶介质PharmaciaBioGelA agaroseBioGel P acrylamideBio-RadSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulos

10、e蛋白质纯化技术第38页 层析装置（Chromatographic equipment）蠕动泵层析柱检测器统计仪个别搜集器蛋白质纯化技术第39页 蛋白质纯化技术第40页蛋白质纯化技术第41页4.1. 层析（ chromatography ）分子筛层析（ Gel filtration ）离子交换层析（ Ion exchange ）疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ）亲和层析（ Affinity ）蛋白质纯化技术第42页4.1.1 分子筛层析 （Gel filtration）原理也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不

11、一样蛋白质所受到阻滞作用不一样而先后流出，从而到达分离纯化目标。凝胶介质葡聚糖 （glucose）琼脂糖 （agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）蛋白质纯化技术第43页分子筛层析Gel filtration chromatographyHydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to allow a high linear flow-rate亲水对蛋白质亲和力低物理化学性质稳定流速稳定蛋白质纯化技术第44页分子筛层析Gel filt

12、ration chromatography蛋白质纯化技术第45页分子筛层析Gel filtration chromatography蛋白质纯化技术第46页分子筛层析Gel filtration chromatography蛋白质纯化技术第47页4.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ）原理在一定pH条件下，不一样蛋白质带有电荷种类和数量不一样，所以它们与带电凝胶颗粒间电荷相互作用不一样。利用蛋白质和带电凝胶之间作用力差异，把蛋白质分开层析方法。蛋白质纯化技术第48页4.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ）种类阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阴离子交换柱：

13、凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷介质惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖带电基团：羧甲基带负电；二乙基氨基带正电平衡离子： 负电基团：H+或Na+ 正电基团：OH-或Cl-蛋白质纯化技术第49页离子交换层析（ Ion exchange ）阳离子交换：阴离子 先，阳离子 后阴离子交换：阳离子 先，阴离子 后蛋白质纯化技术第50页4.1.3 亲和层析（Affinity chromatography）原理利用蛋白质与配体专一性识别并结合特征而分离蛋白质一个层析方法。将配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合。先用缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。蛋白质纯化

14、技术第51页亲和层析（Affinity chromatography）蛋白质纯化技术第52页His-亲合示意图（金属螯合层析）固相载体镍柱（Ni-NTA）PET expression system蛋白质纯化技术第53页4.1.4 疏水作用层析原理蛋白质表面疏水基团与介质疏水配体可逆相互作用方法高离子强度下待分离样品吸附在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱物质先洗脱，疏水强物质后洗脱。蛋白质纯化技术第54页4.2.电泳（ Electrophoresis ）电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反电极移动。蛋白质纯化技术第55页蛋白质常见电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE

15、）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）蛋白质纯化技术第56页4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS：1、覆盖蛋白质表面电荷，消除电荷差异2、改变蛋白质分子构象，消除形状差异蛋白质纯化技术第57页电泳法测目标蛋白分子量蛋白质纯化技术第58页4.2.2不连续PAGE分离蛋白质原理在不连续电泳系统中，所带电荷、分子大小和形状不一样蛋白质在凝胶中能够被分离。原理电荷效应浓缩效应快慢离子效应凝胶浓度差效应分子筛效应蛋白质纯化技术第59页4.2.3 等电聚焦

16、电泳（Isoelectric focusingIEF）蛋白质纯化技术第60页等电聚焦（Isoelectric focusing）蛋白质纯化技术第61页4.2.4 双向电泳第一向：等电聚焦 （pI）第二向：SDS(MW)双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和判定主要试验技术之一。蛋白质纯化技术第62页Isoelectric focusingSDS gel electrophoresis蛋白质纯化技术第63页Two Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visua

17、lized蛋白质纯化技术第64页蛋白质纯化策略方案设计篇Protein purification strategy蛋白质纯化技术第65页三、纯化方案设计标准确定纯化目标purity, activity and quantity充分了解目标蛋白及主要杂质理化特征to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽可能降低纯化步骤extra steps reduce yield and increa

18、se time, combine steps logically蛋白质纯化技术第66页确定纯化目标蛋白质纯化技术第67页三、纯化方案设计标准确定目标purity, activity and quantity充分了解目标蛋白及主要杂质理化特征to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽可能降低纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, c

19、ombine steps logically蛋白质纯化技术第68页三、纯化方案设计标准确定目标purity, activity and quantity充分了解目标蛋白及主要杂质理化特征to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽可能降低纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically蛋白质纯化

20、技术第69页严格依据目标蛋白质特殊生物学性质，来设计活性检测方案 常见检测方法:酶学检测 enzymatic assays.配体检测 ligand-binding assays免疫检测 immunological assays活性测定方法要求：快速、简便、特异和定量确定活性检测方法蛋白质纯化技术第70页三、纯化方案设计标准确定目标purity, activity and quantity充分了解目标蛋白及主要杂质理化特征to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法fast detection of protein activi

21、ty/recovery and critical contaminants 尽可能降低纯化步骤extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically蛋白质纯化技术第71页尽可能降低纯化步骤纯化步骤越多，样品损失越大（产量、活性）蛋白质纯化技术第72页降低每步操作时间to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery降低添加物additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays早期除去降解物（如蛋白酶）for example, proteases每步使用不一样纯化方法to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!尽可能