流感疫苗生产及研究进展

1、流感疫苗生产及研究进展流感疫苗生产及研究进展第1页 内容病毒性灭活疫苗概述1流感和流感病毒2流感疫苗生产工艺33流感疫苗研发44.流感疫苗生产及研究进展第2页病毒性灭活疫苗概述定义及分类病毒接种和培养采取物理或化学方式将病毒灭活其它生产步骤成品培养基质流感疫苗：鸡胚出血热及森脑疫苗：原代地鼠肾细胞狂犬疫苗：Vero 细胞灭活方法：加热灭活剂（福尔马林等）纯化：纯化全病毒疫苗裂解：裂解疫苗亚单位：亚单位疫苗纯化全病毒疫苗：冻干人用狂犬病疫苗出血热、森脑-含氢氧化铝佐剂裂解：流感病毒裂解疫苗灭活疫苗：称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养完整病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持

2、免疫原性，并结合对应佐剂而制成疫苗。.流感疫苗生产及研究进展第3页长春企业病毒性灭活疫苗 工艺流程名称病毒培养病毒纯化病毒裂解病毒灭活半成品配制及分包装冻干人用狂犬病疫苗基质：Vero细胞培养方式：生物反应器超滤浓缩；柱层析（分子筛）无灭活剂：-丙内酯冻 干双价肾综合征出血热疫苗森林脑炎灭活疫苗基质：原代地鼠肾细胞方式：转瓶超滤浓缩；柱层析（分子筛）无灭活剂：甲醛含铝佐剂流感病毒裂解疫苗基质：鸡胚方式：孵化间超滤浓缩；蔗糖密度区带离心裂解剂：Triton X-100灭活剂：甲醛无硫柳汞.流感疫苗生产及研究进展第4页两种灭活剂比较简明介绍灭活机理优缺点甲醛甲醛，化学式HCHO，称蚁醛。无色气体，

3、有特殊刺激气味，对人眼、鼻等有刺激作用。既可作用于病毒含氨基核苷酸碱基（如A,G,U），又可作用病毒壳蛋白。1）病原体蛋白抗原性严重破坏，可能有病原体存活；2）灭活时间长；3）易受温度、pH、浓度、是否存在有机物、病原体种类和含氮量等原因影响；4）残留游离甲醛，注入机体后，会产生制激性反应。-丙内酯一个杂环类化合物(C3H4O2)，沸点155，常温下是无色粘稠状液体，对病毒含有很强灭活作用。作用于病原体DNA或RNA，改变病毒核酸结构抵达灭活目标，而不直接作用于蛋白。1）不破坏病毒血凝素抗原, 保持病毒良好免疫原性；2）灭活时间短；3）其水解产物对机体无害，接种反应轻。.流感疫苗生产及研究进展

4、第5页常见裂解剂简明介绍机理Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚,是一个非离子型表面活性剂（或称去污剂）它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜通透性。Triton N-101聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一个非离子型表面活性剂（或称去污剂）溶解脂质CTAB十六烷基三甲基溴化铵,阳离子表面活性剂，是一个阳离子去污剂与非离子及两性离子表面活性剂有良好配位性，对各种油脂具很好乳化作用, 有轻微脱脂作用.流感疫苗生产及研究进展第6页流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别引发急性呼吸道传染病。常造成不一样程度流行，对人类健康造成巨大威胁。慢性病恶化、继发感染

5、、其它- 痛苦不堪- 缺课或缺勤- 就医- 使用抗生素- 住院- 死亡流感流感和流感病毒.流感疫苗生产及研究进展第7页流感流行特点是在短期内突然发生，快速蔓延，造成不一样程度流行，包含世界大流行，局部暴发流行及散发。含有一定季节性：温、寒带地域常在冬、春季节流行，但热带和亚热带地域任何季节都能够流行。流感病毒传输快速、流行广泛、抗原易变异，人群特异性免疫情况不稳定。发病率高，并伴有一定死亡率。最高为青少年，高危人群为年迈体弱或带有慢性疾病患者。每次流感流行后在人群中总要造成不一样程度超额死亡。流感患者和隐性感染者是流感主要传染源。从潜伏期末到发病急性期（约7天）都有传染性。死亡率升高超出一定正

6、常临界水平.流感疫苗生产及研究进展第8页流感病毒形态结构.流感疫苗生产及研究进展第9页流感病毒超细微结构照片流感病毒电镜照片流感病毒形态结构.流感疫苗生产及研究进展第10页.流感疫苗生产及研究进展第11页.流感疫苗生产及研究进展第12页.流感疫苗生产及研究进展第13页.流感疫苗生产及研究进展第14页.流感疫苗生产及研究进展第15页 甲型流感病毒基因组各节段大小与功效 节段 长度（bp）编码蛋白 主要功效RNAI 2341 PB2 RNA转录酶；识别和结合起源于宿主细胞帽子RNA2 2320 PB1 RNA转录酶主要成份；开启转录和RNA合成延伸RNA3 2233 PA 含有解旋酶话性RNA4

7、1778 HA 结合靶细胞受体，诱导病毒与靶细胞融合诱导中 和抗体，凝集红细胞RNA5 1565 NP 与基因组RNA结合，参加形成核糖核蛋白（RNP） 颗粒RNA6 1413 NA NA活性；水解细胞多糖受体，帮助新生病毒颗 粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促使子代病 毒释放RNA7 1027 M1、M2 病毒基质膜蛋白，有保护作 用；质子通道作用RNA8 890 NS1、NS2 非结构蛋白，抑制宿主细胞蛋白合成或参加 vRNA合成.流感疫苗生产及研究进展第16页 流感病毒理化特征 流感病毒对热敏感，通常5630min被灭活，但有些毒株5690min被灭活。 最适PH为7.0-8.0可被紫外

8、线灭活因其为带囊膜病毒，故对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂敏感。.流感疫苗生产及研究进展第17页流感病毒变异原因：流感病毒结构特点天然宿主广泛存在亲密接触方式： 抗原漂移（Antigenic drift） -小变异，同一亚型 -基因点突变所致 -引发流行抗原转换（Antigenic shift） -大变异 -基因片段交换 -引发大流行.流感疫苗生产及研究进展第18页抗原漂移（Antigenic Drift）RNASialic acidAntibodiesHemagglutininNeuraminidaseHA 和/或 NA 基因点变异 频繁发生 A 型和B型发生.流感疫苗生产及研究进展第19页抗原

9、转换（Antigenic shift)人类和动物毒株RNA发生交换 (HA 和/或NA基因全球性变异),造成新亚型出现 少见但后果严重 只在 A型出现 .流感疫苗生产及研究进展第20页1918194019601980H1N1H2N2H3N2H1N1H1N11918Spanish Influenza H1N11957Asian Influenza H2N21968Hong Kong Influenza H3N2Novel Influenza H1N1 H7 19801985199519751996 H51997 H91999流感流行情况.流感疫苗生产及研究进展第21页抗原漂移所引发历史上流感流行

10、 PB1HANAPB1NA.流感疫苗生产及研究进展第22页N Engl J Med 10.1056/nejmoa0903810甲型H1N1流感病毒4种不一样起源基因 4 different genes:北美猪流感病毒 North America swine欧亚猪流感病毒 Asia/Europe swine人流感病毒 Human influenza禽流感病毒 (非H5) Avian (Non-H5).流感疫苗生产及研究进展第23页流感试验室诊疗.流感疫苗生产及研究进展第24页 流感已成为全球患病人数最多一类疾病。接种流感疫苗是当前预防和控制流感最经济、最有效伎俩，已被广泛采取，并证实有效率到达

11、70以上。流感疫苗.流感疫苗生产及研究进展第25页 当前，使用流感疫苗是三价，包含两种甲型（H1N1，H3N2）和一个乙型(B)流感病毒抗原成份，应用最广泛有： 灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁 当前主要应用疫苗种类.流感疫苗生产及研究进展第26页 灭活疫苗种类和生产工艺全病毒疫苗 裂解疫苗 亚单位疫苗第一代全病毒价格较低，但副反应较高，个他人群不宜接种，已逐步淘汰第二代裂解接种效果好，临床副反应较少，适合各年纪段人群接种第三代亚单位有效抗原含

12、量高，更安全，价格较高灭活疫苗种类.流感疫苗生产及研究进展第27页3-4月份10-11月份WHO公布毒株生产企业取得和培育毒株疫苗生产销售每年世界卫生组织依据上一年流感病毒流行情况预测下一年度流感病毒流行株并向各生产企业公布从WHO合作试验室取得病毒疫苗株，并将病毒在鸡胚内培养，制备毒种将病毒接种到鸡胚内培养，收获尿囊液，经纯化、灭活、裂解后制备成疫苗2月份9月份5-9月份12-第二年4月9月-第二年2月份5月-9月生产周期5-6个月生产工艺.流感疫苗生产及研究进展第28页生产工艺.流感疫苗生产及研究进展第29页单价原液制备.流感疫苗生产及研究进展第30页毒种和病毒尿囊液制备毒种MOI接种量温

13、湿度培养时间通风温度时间颜色量.流感疫苗生产及研究进展第31页选胚.流感疫苗生产及研究进展第32页.流感疫苗生产及研究进展第33页.流感疫苗生产及研究进展第34页.流感疫苗生产及研究进展第35页.流感疫苗生产及研究进展第36页接种.流感疫苗生产及研究进展第37页.流感疫苗生产及研究进展第38页培养.流感疫苗生产及研究进展第39页收获.流感疫苗生产及研究进展第40页纯化.流感疫苗生产及研究进展第41页.流感疫苗生产及研究进展第42页裂解.流感疫苗生产及研究进展第43页.流感疫苗生产及研究进展第44页.流感疫苗生产及研究进展第45页.流感疫苗生产及研究进展第46页.流感疫苗生产及研究进展第47页.

14、流感疫苗生产及研究进展第48页产品名称检定项目药典标准主代种子无菌检验无菌生长血凝滴度不低于1：320支原体检验符合要求判别试验采取交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml外源性禽白血病病毒检测阴性外源性禽腺病毒检测阴性工作种子无菌检验无菌生长血凝滴度不低于1：320支原体检验符合要求判别试验采取交叉血凝抑制法，P/N不低于8病毒滴度不低于6.5Lg EID50/ml质量控制.流感疫苗生产及研究进展第49页中间产品质量控制中间品检定项目长春企业企业注册标准病毒收获液微生物程度105CFU/ml沙门氏菌阴性血凝滴度1:160细菌内毒素10EU/ml蛋白含量3.5m

15、g/ml病毒浓缩液蛋白含量10mg/ml细菌内毒素160EU/ml病毒纯化液蛋白含量2.0mg/ml病毒裂解纯化液蛋白含量0.5mg/ml病毒灭活纯化液细菌内毒素0.2EU/ugHA灭活验证试验符合要求微生物程度10CFU/ml.流感疫苗生产及研究进展第50页单价病毒原液质量控制单价病毒原液检定项目长春企业企业注册标准判别试验抗原性与推荐病毒株相一致血凝素含量90ug/ml蛋白含量不高于血凝素含量4.0倍无菌检验符合要求病毒裂解效果检验病毒颗粒应裂解完全。每次更换流感病毒毒株后生产前三批单价病毒液须进行该项检验。.流感疫苗生产及研究进展第51页一些病毒能够与人或动物红细胞发生凝集，这称之为红细

16、胞凝集反应（HA）。这种凝集反应被加入特异性血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI）。血凝和血凝抑制试验.流感疫苗生产及研究进展第52页血凝和血凝抑制试验.流感疫苗生产及研究进展第53页 血凝素含量检测（单扩）.流感疫苗生产及研究进展第54页标准直线.流感疫苗生产及研究进展第55页半成品质量控制半成品检定项目长春企业企业注册标准无菌检验符合要求血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量应为配制量80%120%裂解剂残留量150ug/ml.流感疫苗生产及研究进展第56页成品检测指标成品检定项目长春企业规程标准判别试验抗原性与推荐病毒株相一致外观微乳白色液体，无异味装量应不低于标示量pH值6.8

17、7.8血凝素含量每1ml中各型流感病毒血凝素含量应为配制量80%120%游离甲醛含量50ug/ml卵清蛋白含量100ng/ml总蛋白含量350ug/ml,不高于血凝素总含量3.5倍细菌内毒素20EU/ml抗生素残留量50ng/剂无菌检验符合要求异常毒性检验符合要求.流感疫苗生产及研究进展第57页当前广泛应用流感疫苗季节性四价流感疫苗细胞基质流感疫苗喷鼻减毒活疫苗基因工程流感疫苗病毒样颗粒、病毒载体及DNA流感疫苗通用流感疫苗研发与展望.流感疫苗生产及研究进展第58页疫苗效果影响原因.流感疫苗生产及研究进展第59页 接种疫苗是当今预防和控制流感发生和流行最有效伎俩。当前，使用流感疫苗是三价，包含

18、两种甲型（H1N1，H3N2）和一个乙型(B)流感病毒抗原成份，应用最广泛有： 灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁当前广泛应用流感疫苗.流感疫苗生产及研究进展第60页多年获批上市新型流感疫苗充实一下新型流感疫苗表疫苗种类商品名厂家同意地批按时间剂量对象备注佐剂疫苗Fluad Novartis 欧洲199765YMF59/AS03皮内注射疫苗Intanza/ IDflu Sanofi Pasteur欧洲9g/株15g/株18-59Y60Y高剂量疫苗

19、Fluzone Sanofi Pasteur美国60g/株65Y细胞培养疫苗Influvac TCSolvay Pharmaceuticals Inc 荷兰MDCKOptaflu Novartis 欧洲亚单位18YMDCKFlucelvaxNovartis美国亚单位18YMDCKCeltura Novartis欧洲H1N1pdm09亚单位MF59Celvapan Baxter欧洲H1N1pdm09全病毒6MVEROPreflucel Baxter美国裂解18-49YVERO重组HA疫苗FluBlok Protein Science 45g/株18-49Y.流感疫苗生产及研究进展第61页 198

20、5年后在全球流行原单一谱系B型流感病毒BYamagata，逐步演变为二种抗原性截然不一样BVictoria和BYamagata二个谱系交替或者一个谱系为主混合流行。这二个谱系B型病毒之间极少或者没有交叉保护甲型和乙型流感病毒血凝素基因进化树四价流感疫苗背景.流感疫苗生产及研究进展第62页批按时间同意单位生产厂家疫苗名称疫苗类型使用方式适用人群02月美国FDA阿斯利康旗下子企业MedImmuneFluMist Quadrivalent vaccine减毒活疫苗鼻腔喷雾2-49岁12月美国FDA葛兰素史克企业Fluarix裂解疫苗肌肉注射3岁以上08月美国FDA葛兰素史克企业FluLaval Quadrivalent裂解疫苗肌肉注射3岁以上06月美国FDA赛诺菲巴斯德企业Fluzone Quadrivalent裂解疫苗肌肉注射6个月以上12月欧盟阿斯利康企业Flu