临床免疫学检验：细胞因子及其受体的检测

1、细胞因子及其受体的检测第十六章细胞因子(cytokine)的基本特征天然细胞因子是一类具有多种生物学功能的小分子活性物质，多数为蛋白质/糖蛋白/多肽，由免疫细胞或者非免疫细胞在接受外界刺激的情况下分泌。分子量介于6,000-60,000D。通常情况下，细胞因子极少储存，即不以前体形式贮存在细胞内，而是经过适当刺激后迅速合成，一旦合成后便分泌至细胞外以发挥生物学作用，刺激消失后合成亦较快地停止并被迅速降解。细胞因子需与靶细胞上的高亲和力受体特异结合后才发挥生物学效应。细胞因子在pM(10-12M)水平就能发挥显著的生物学效应。这与细胞因子与靶细胞表面特异性受体之间亲和力极高有关，其解离常数在10

2、-1210-10M之间。主要参与免疫反应和炎症反应 影响反应的强度和持续时间的长短。涉及到感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫等诸多方面。某种细胞因子对靶细胞作用的强弱取决于细胞因子的局部浓度，大多是在近距离发挥局部作用 ；存在着高效性/多效性/重叠性/协同性/拮抗性等特点；细胞因子的作用并不是孤立存在的，它们之间通过合成分泌的相互调节，受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响而组成细胞因子网络也可以取得协同效应，甚至取得两种细胞因子单用时所不具有的新的独特的效应。1、造血素家族（hematopoietin family） 白细胞介素（IL）, 集落刺激因子（CSF）2、干扰素家族（inte

3、rferon family） IFN-/3、肿瘤坏死因子家族（tumor necrosis factor family） TNF- / 、FasL、TRAIL4、趋化因子家族（chemokine family） 细胞因子(cytokine)的分类细胞因子的生成和功能细胞因子的作用方式细胞因子的功能特点1、多效性2、重叠性3、协同性4、拮抗性5、级联效应细胞因子的测定方法一、蛋白质水平1、生物学测定法： 活性单位2、免疫学测定法： 质量单位二、基因水平1、分子生物学测定法： DNA/RNA水平生物学测定法的基本类型一、细胞增生法1.基本原理： 细胞因子促细胞生长、分裂。 2. 指示细胞 依赖细胞

4、株:依赖于某一细胞因子而存活，且在一 定浓度范围内与细胞增生呈正相关。 3. 基本步骤 制备依赖细胞株 空白对照/加入标准品/待测样品 共培养，并检测 （H3-TdR渗入法、MTT比色法） 计算活性单位 H3-TdR渗入法：H3 标记的胸腺嘧啶核苷酸掺入新合成的DNA。 放射活性每分钟脉冲数（CPM）MTT法：MTT被活细胞线粒体内酶氧化还原成不溶蓝紫色颗粒甲瓒DMSO溶解。二、靶细胞杀伤或抑制法1. 基本原理： 细胞因子的细胞毒性。肿瘤坏死因子 家族（TNF-/,TRAIL,FasL）2. 敏感细胞株3、基本步骤 制备敏感细胞株 空白对照/加入标准品/待测样品 共培养，并检测 （计算死细胞或

5、者活细胞） 计算活性单位51Cr释放法：首先用51Cr标记敏感细胞细胞因子共培养检测释放到培养基中的51Cr结晶紫染色法：专染活细胞脱色液洗脱特定波长吸光度变化三、细胞病变抑制法1、基本原理 根据干扰素的抗病毒特性，将细胞、病毒、 IFN置同一培养体系中，细胞病变程度同IFN的 活性成反比。2、指示细胞和病毒3、基本步骤 制备指示细胞和病毒 空白对照/加入标准品/待测样品 共培养，并检测 （镜检或者MTT法/结晶紫染色法定量） 计算活性单位四、趋化因子测定法1、基本原理趋化因子能够以浓度依赖性的形式趋化免疫细胞定向运动。利用Boyden小室，在下室加入IL-8或者待测样品及硝酸纤维素膜，上室加

6、入中性粒细胞，共培养后检测中性粒细胞向下室迁移的程度。计算迁移指数：实验组细胞/阴性组细胞；实验组迁移距离/阴性组迁移距离；生物学检测法的评价一、优点1、能真实反应细胞因子在体内发生作用的情况；2、具有较高的灵敏度；3、不需商品化试剂盒，成本低；二、缺点1、特异性不强；敏感株，抗体封闭干扰物2、操作繁琐，需要细胞培养，周期长；3、影响因素多，重复性差。免疫学检测法的基本类型一、体液中细胞因子的检测1、酶联免疫吸附技术（ELISA）： 双抗体夹心法2、放射免疫分析3、抗体芯片技术4、酶联免疫斑点技术（ELISpot）Enzyme-linked immunospot assay (ELISpot）

7、二、细胞内细胞因子的检测 淋巴细胞 刺激剂（佛波酯离子霉素） 蛋白分泌抑制剂（莫能星/布雷菲德菌素A） 固定和破膜 荧光素标记抗细胞因子抗体 流式分析 （IL-4/IFN-gamma）免疫学检测法的评价一、优点1、特异性高；antibody-antigen2、操作方便，时间短；3、重复性好；二、缺点1、测定细胞因子蛋白含量，与生物活性不一定呈正相关，有时与临床症状不一致；2、灵敏度不如生物学测定法；pg-ng 3、标本处理要适当；分子生物学检测法的基本类型一、DNA水平检测1、Southern印迹杂交2、斑点印迹杂交/原位杂交3、PCR/原位PCR4、荧光定量PCR检测细胞因子基因有无缺失、突

8、变或多态性；二、RNA水平检测1、荧光定量PCRSouthern杂交Realtime PCR荧光探针/荧光染料分子生物学检测法的评价一、优点1、对基因异常，如突变，缺失，染色体易位等进行检测；2、原位分析利于精确定位；二、缺点实验室条件要求较高细胞因子受体检测技术一、膜结合受体的检测1、免疫组织化学检测；2、流式细胞分析；3、生物学测定法；二、可溶性受体的检测1、ELISA 白细胞分化抗原和细胞 黏附分子的检测细胞膜分子（细胞表面分子）：主要包括1、膜抗原，如mIg；2、膜受体，如补体受体，胰岛素受体；3、白细胞分化抗原/分化群；4、细胞黏附分子；5、离子通道蛋白；第十七章白细胞分化抗原及其检

9、测1、白细胞膜表面分子，leukocyte differentiation antigen, LDA /cluster of differentiation CD,常以 受体或配体的方式参与信号传导，如CD4/8; CD16; CD59;CD80-CD28/CTLA-4；2、可以用作分型标志；3、作为受体（如CD3、CD14、 CD40、CD16/32/64）或细 胞膜型配体（如CD154、CD80/86）起传递信号的作用；4、作为细胞粘附分子（如CD34、CD56）介导细胞的迁移， 黏附；5、以可溶形式存在于体液中；6、其表达并不局限于白细胞；白细胞分化抗原及其检测一、膜型CD分子1、流式细

10、胞分析术；2、免疫组化技术；二、可溶性CD分子1、ELISA白细胞分化抗原检测意义1、免疫功能评价；2、血液病的分型与辅助诊断；3、血栓与出血性疾病的诊断；4、AIDS的诊断；5、疾病发病机制的研究；6、可溶性CD分子与疾病的关系；细胞黏附分子（CAM）及其检测1、一类介导细胞间及细胞与细胞外基质间黏附作用的糖蛋白，可以膜型和可溶型两种形式存在；2、白细胞、血管内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞等均可表达；3、介导免疫细胞的迁移、归巢、细胞间的相互作用；细胞黏附分子（CAM）及其检测4、按其结构特点主要分为6类：a、钙离子依赖性家族，又称钙粘素(cadherin)；b、整合素家族（integrin family）；c、免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）;d、选择素家族（selectin family）；e、黏蛋白样家族（mucin-like）;f、其他黏附分子5、粘附分子以配体一受体相对应的形式发挥作用，导致细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞之间的粘附，参与细胞的信号转导与活化、细胞的伸展和移动、细胞的生长及分化、炎症、血栓形成、肿瘤转移、创伤愈合等一系列重要生理和病理过程。6、在体内，一种细胞可能同时