临床免疫学检验：人类白细胞抗原分型

1、 人类白细胞抗原分型 （HLA typing）教学目标：1. 掌握：HLA血清学分型的原理与特点；等位基因分 型的类型、原理和特点； 2. 熟悉：HLA系统的命名和标准化； 3. 了解：细胞学分型。3,838,986 bp224 geneson chromosome 6HLA分子的结构和生物学功能HLA分子：即人类白细胞抗原，由位于第6号染色体短臂上的一群紧密连锁的基因群编码的细胞膜糖蛋白，参与细胞间的识别和抗原递呈, 引起适应性免疫反应和免疫调节。按其分子结构和功能分为两类：HLA Class I: HLA-A, B, Cw;HLA Class II: HLA-DR, DP, DQ;Deta

2、iled map of the HLA region.uk/HIG/data.html October 2003 updateHLA Class I HLA-I类分子是由，双链构成的异源二聚体，其中链由HLA-A,B,C基因座位编码，链又被成为2微球蛋白，由15号染色体编码，2微球蛋白具有保守性。可广泛地表达于各种组织的有核细胞上，以LC表面的表达密度最高（105分子/细胞），成熟的RBC，神经细胞及滋养层细胞则不表达。HLA-I类抗原的主要生物学作用是向CD8Tc递呈内源性抗原，产生细胞免疫。HLA Class IIHLA-II分子是由，肽链构成的异源二聚体，但是其两条链分别有HLA-DR,

3、DP,DQ的A和B基因位点编码。相对I类抗原来讲，二类抗原仅在抗原递呈细胞上表达，比如DC细胞，B淋巴细胞，巨噬细胞等。人类白细胞II类抗原主要向CD4+Th淋巴细胞递呈外源性抗原，可间接活化B淋巴细胞，从而产生体液免疫。 为什么要做HLA分型? HLA复杂的遗传特征；2.HLA分型在现代医学中的重要作用；HLA的遗传特征：1.高度多态性：复等位基因, 共显性表达2.单倍型遗传:具有多基因性HLA 的遗传特征：高度多态性： 1. 复等位基因：指在一随机婚配的群体中，染色体的同一基 因座位有两种以上基因型，即可能编码两种以上的产物。2. 共显性：来自父亲和母亲的一对等位基因均能转录、翻译成HLA

4、分子，共同表达于细胞膜上。一方面增加其抗原递呈能力，利于保护自身，另一方面也增加了表型的多样性，造成其细胞膜表面抗原的复杂性。 3. HLA系统是已知人类基因序列中多态性最多的。 HLA多态性是不同个体间组织不相容的分子基础。 单倍型遗传：单倍型：紧密连锁在同一染色体上的HLA各座位上的基因组合。单倍型遗传：单倍型之间发生同源重组的机率很低，常以一整套遗传给子代。HLA多态性基因的随机组合造成不同个体间获得HLA完全匹配的机率极低，但是由于单倍型的整体遗传，使得不同个体间获得HLA主要位点匹配成为可能。HLA 的遗传特征：HLA与疾病的关系1.HLA与疾病的相关性：某些疾病的发生与一种或几种H

5、LA抗原的表达具有直接或间接相关性，因此HLA作为一种疾病发生的遗传标志可用于疾病的辅助诊断、预测、分类及预后判断,如病毒的易感性,I型糖尿病的发病,疫苗的效果相关。2.HLA与器官移植中的排斥反应相关：主要组织相容性抗原，发生器官排斥反应的主要因素，供受体间HLA的相似性越强，器官移植的成活率越高。通常最佳的移植物配对关系顺序为同卵双生同胞兄妹近亲远亲无亲缘者。什么是HLA分型和如何进行HLA typing ？B.等位基因型：核苷酸序列特异性；A.特异型：抗原特异性；HLA Typing1. 血清学分型/Serological typing2. 细胞学分型/Cellular typing3.

6、 分子生物学分型 /Gene typing如何做HLA Typing？血清学分型原理: 血清学分型是最简单，快速的方法。其基本原理是补体依赖的细胞毒实验，主要对HLA-A/B/C位点进行分型，A/B/C编码抗原又被称为SD抗原。血清学分型实验流程 1.收集标本，密度梯度离心法 分离白细胞/淋巴细胞2.加约2,000个外周血细胞于已经预先加有不同类型抗血清的反应板中，混匀后在20-25c.下温育30 分钟 3. 每孔加5微升5补体，继续 于20-25c 温育60分钟4.每孔加5伊红水溶液3微升，孵育5分钟后加固定液12甲醛5微升 5.观察结果血清学分型结果判定结果判定分为两步：1.首先通过镜检，

7、给每一种特异性抗血清反应结果打分。根据每孔中死细胞的百分率打分，分为五个等级：强阳性；阳性；阳性可疑；阴性可疑；阴性。2. 根据打分结果，首先选出强阳性反应抗血清类型，再根据多数原则指定抗原 特异性。Table1 Scoring the cytotoxicity test for HLA typing%Dead lymphocytesin Test WellScoreInterpretation0-101Negative11-202Doubtful negative21-404Doubtful positive41-806Positive808Strong Positive记分表血清学分型主要

8、影响因素：1.选用不同类型靶细胞，如单核细胞，T-淋巴细胞； B-淋巴细胞； 2.抗血清: 多克隆抗体/基因工程单抗，不同类型 抗原间存在交叉反应，通常用两份以上抗血清； 3.补体: 常用的兔补体中含有能够结合淋巴细胞的 嗜异性抗体，可能引起假阳性，在操作中要做好 标本对照以排除此类现象； 温育时间和温度: 如孵育时间不够，造成抗原抗体不能充分结合，易造成结果的假阴性；5.个人主观经验细胞学分型利用混合淋巴细胞培养（MLC）的方法来判定HLA-II类抗原，分为双向和单向混合淋巴细胞培养。传统上用于对HLA-D抗原分析，HLA-D抗原又被称为LD抗原。细胞分型的特点1. 用于分型鉴定的标准细胞株

9、的来源和保存都比较困难，而且混合淋巴细胞培养实验本身操作繁琐耗时，使其难以广泛推广，目前正逐渐被基因分型方法所取代。基因分型1. 基因分型是根据不同等位基因之间DNA序列的差异判断个体间的HLA基因型，与前两种方法相比，基因分型法并不要求活的淋巴细胞，任何组织来源的含基因组DNA的细胞均可用来做HLA分型。2.主要包括四种： PCR-RFLP: PCR限制性片断长度多肽性分析法; PCR-SSOP: PCR序列特异性寡核苷酸探针杂交法； PCR-SSP: PCR序列特异性引物分型法; PCR-SBT: PCR序列测定法；聚合酶链反应（PCR） 在多聚合酶，引物，底物和模板的参与下通用变性，退火

10、，延伸三个循环步骤在短时间内达到对目的片断的大量扩增，是基因分型的基础。SSP/RFLP DNA 提取 DNA 扩增 (限制性内切酶酶切) 检测 SSP/RFLPSSOPDNA 抽提 DNA 扩增/合成探针印迹（正向/反向） 杂交检测SSOP SBT DNA 抽提 DNA 扩增 测序 检测基因分型各种基因分型方法比较方法主要试剂主要过程多态性类型SSP序列特异性引物PCR/凝胶电泳一段核苷酸序列RFLP限制性内切酶PCR/酶切/凝胶电泳酶切位点SSOP序列特异性寡核苷酸探针PCR/杂交一段核苷酸序列SBT标记的引物/标记的双脱氧核苷酸PCR/测序核苷酸水平方法血清学分型/细胞分型基因分型(SS

11、P/SSOP/SB)识别位点HLA分子抗原特异性，某些氨基酸残基位点DNA序列差异分辨率低（抗原特异性）HLA-A01低（抗原特异性）/中等（集团特异性）/高（等位基因特异性）HLA-A*01；HLA-A*0101/0102/0103； HLA-A*0101抗原法/基因法字母HLA代表染色体上一段特殊的遗传区域（人类白细胞表面抗原区域）；A/B/DR代表该区域某一具体的基因座位；数字代表该基因座位编码的特异性抗原（血清型）。括号内的数字表示前一抗原是该抗原的“剪切产物”(存在抗原决定簇交叉现象)。 抗原名（antigen names）HLA Typing 的命名和结果的标准化2. 等位基因名(

12、allele names)基因座位与数字之间加入*号；1,2位数字代表其血清型；3,4位 数字代表存在引起编码序列不同的多态性；5,6位数字代表存在不引起编码序列差异的多态性；7,8位数字代表在内含子、5、3端存在多态性；字母表示HLA基因的表达状态，如L/C/S/N;HLA抗原特异型和等位基因型比较HLA字典 随着基因分型数据的增加，出现一些等位基因名称中的前两位数字并不代表其抗原特异性的情况（如HLAB*1303:B49 ?）。 为此世界骨髓捐赠协会（WMDA）发起了一项专门研究HLA分子的抗原特异性如何与等位基因位点对应起来的研究，以便不同研究单位和医疗机构参考。该研究报告自1997年首次公布以来，已多次更新补充，此报告又被成为HLA字典。2008 WHO 1. 在等位基因名称中引入冒号； 如： A*01010101 A*01:01:01:01 DRB1*01010101 DRB1*01:01:01:012.在等位基因数目已经超过100的基因中，采用新的编码方法： 如： A*02和B*15