临床免疫学检验：免疫检验的自动化仪器分析

1、免疫检验的自动化仪器分析课程意义掌握常用免疫自动化仪器的检测原理；了解临床免疫检测的自动化现状和自动化检测系统相关实习内容。课程内容免疫检测自动化简介自动化免疫浊度分析系统自动化发光免疫分析系统全自动酶免分析系统自动化荧光免疫分析系统自动化检测系统实习内容小结什么是“免疫检验的自动化”将免疫检验过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动化进行。自动化分析单克隆技术基因工程技术免疫标记技术计算机技术仪器学 手工操作 检测项目灵敏度 精密度检测速度劳动强度 免疫分析自动化免疫自动化检测应用领域内分泌激素肿瘤标志物病毒标

2、志物心肌标志物血浆特种蛋白维生素药物浓度Ag+Ab“电解质”IC（ 19S）浊度IC 浊度 待测Ag量Ab稍微过量且固定 待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关浊度的检测分析免疫透射比浊法（turbidimetry） （吸光度）免疫散射比浊法（nephelometry） 自动化免疫浊度分析系统入射光线 样品 被吸收、反射、折射 减弱 吸光度与IC量呈正相关，Ab稍微过量且固定,IC量与参与反应的抗原量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。（一）原理一、免疫透射比浊法 （二）技术要点1.至少5个浓度的标准抗原.2.加适当过量抗血清，反应完成后，测各管A340nm。3.备剂量-反

3、应曲线，计算出抗原浓度。（三）方法评价 优点: 灵敏度提高，稳定性好，操作简便，结果准确。 不足: 抗体用量较大（过量）； IC要足够大(35-100nm)、足够多； 耗时较长。 (一) 原理三、免疫散射比浊法光线照射 微粒子 反射和折射 散射光 散射光强度：与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关原理：1、保证抗体过量； 2、避开不稳定阶段； 3、抗原过量的检测时段检测分两个在抗原抗体预反应时段，加小量样本， （7.5s2min）测定第一次散射光信号值加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号信号峰值计算机处理转换为样品浓度(二)定时散射比浊法（fixed ti

4、me nephelometry）定时散射比浊法的抗原过量检测 抗体适当过量,保证一定的线性范围，尽量避免抗原过量。 (2)检测分阶段进行，第一阶段加小量样本，并对检测峰值进行阈值限定 ，超过阈值即进行稀释后再行检测。 仪器测定技术要点 抗原抗体预反应阶段： 1/10量标本，7.5120s内，散射光信号阈值，才行下一步，否则稀释后再行测定。(2) 反应阶段：全量标本测定；全过程需4min，耗时较长。(3) 信号检测 ：计算机换算为待测抗原浓度原理：抗原抗体结合反应的动力学测定法。速率：单位时间内形成IC量（不是IC总量）速率峰值的大小与抗原浓度呈正相关。（三）速率散射比浊法（rate nephe

5、lometry）累计时间（s）形成IC总量速率累计时间（s）形成IC总量速率 5 810 13 515 251220 603525 1509030 2308035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20 抗原抗体复合物形成的速率仪器测定技术要点 开启机器，进行定标 反应阶段 ：动态监测反应速度抗原过量检测-加入标本反应结束后再加入标准抗原，看是否出现第二个速率峰抗体过量第一峰值信号(四)散射比浊法方法评价 散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的

6、准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量要求很高。吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关（一）原理二、免疫胶乳比浊法（二）方法评价敏感度高，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；RF可致非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG即可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。1.抗原抗体比例（抗体适当过量） 2.抗体的质量 （高质量R型抗体）3.增浊剂的使用 （种类、浓度合适） 4.伪浊度 （常见原因） 5.标准曲线制备与质量控制 (定标，质控血清)免疫比浊分析的影响因素 四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用免疫比浊分析临床应用免疫球蛋白

7、检测：IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体检测:C3、C4；血浆蛋白检测:前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列自动化发光免疫分析系统吖啶酯标记化学发光免疫分析仪酶联发光免疫分析仪电化学发光免疫分析仪全自动化学发光分析仪化学发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术。该技术不仅具有化学发光分析的高灵敏度和抗原

8、抗体反应的高特异性，还能实现自动化分析，是一种广泛应用的临床免疫分析技术。 反应本质抗原抗体的特异性结合反应。反应类型夹心法、间接法、竞争法等。技术要点1：抗原抗体的标记标记意义：示踪抗原抗体反应标记物质：发光物质或酶（可催化发光底物发光）常用的发光底物：吖啶酯、三联吡啶钌、鲁米诺、AMPPD、4-甲基伞形酮等。技术要点2：磁性微粒子分离技术实现非均相反应磁性微粒子结构吖啶酯标记化学发光免疫分析吖啶酯标记（发光迅速、强度大、时间短、反应简单、干扰物质少、背景噪声低，保证了检测的准确。）磁性微粒子分离技术 吖啶酯标记化学发光免疫测定示意图 ALBORT I2000电化学发光免疫分析仪三联吡啶钌标

9、记，三丙胺为电子供体（发光稳定，持续时间长）生物素放大技术磁性微粒子分离技术电化学发光原理底物：三联吡啶钌Ru(bpy)2+3 N羟基琥珀酰胺酯(NHS) 三丙胺(TPA) 在电极阳极表面，以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧化反应，2价的Ru(bpy)2+3 标记物被氧化成3价的Ru(bpy)3+3 的标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+* ， TPA+* 很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA* ，其为强还原剂，将一个电子给3价的Ru(bpy)3+3 ，使其成为激发态的Ru(bpy)2+3 ，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰减时发射一个波长62

10、0nm的光子，重新形成基态的Ru(bpy)2+3 。这一过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子。使得光信号增强。电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定工作示意图酶联发光免疫分析仪特点测定过程与ELISA相似，不同在于最后一步酶反应的底物改为发光剂，测定的仪器为光信号检测仪，固相载体为磁珠或塑料锥形小管。酶标记抗原或抗体结合稳定酶催化的发光反应稳定，持续时间长，便于记录和测定。碱性磷酸酶标记的化学发光免疫测定示意图 三类型仪器的对比仪器标记物质发光类型发光特点I2000吖啶酯直接化学发光发光迅速、强度大、时间短、反应简单、干扰物质少、背景噪声低。E170三联吡啶钌电化学发光三丙胺为电子供体

11、，发光稳定，持续时间长。DXI800碱性磷酸酶酶促发光酶催化的发光反应稳定，持续时间长，便于记录和测定。 时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay, TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，标准曲线范围宽等特点，已在临床实验室广泛使用。 一、时间分辨荧光免疫分析仪 荧光寿命长：101000s，时间差-时间分辨 Stokes位移大：270nm，易分辨发射光谱带很窄：波长61310nm，降低本底 荧

12、光标记物的相对比活性高。（激发光源为脉冲氙灯，1000次/秒） 信号增强激发光谱带较宽：波长300350nm，提高灵敏度镧系元素（Eu3、Tb3）：（一）基本原理时间分辨荧光法检测原理1. TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用试剂和器材应尽量防尘。 2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大差异。（二）注意事项 全自动酶联免疫分析系统分为二类：一类为连体机。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加

13、试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。一类为分体机， “前处理系统”（全自动样本处理工作站）“后处理系统”（全自动酶免分析仪）。 全自动酶联免疫分析系统构成前处理条形码识别系统 样本架和加样系统 试剂架等结构后处理温育系统液路系统 洗板系统 酶标板读数仪 自动装载传递系统 FAMESTAR全自动酶免系统使用注意事项所有手工操作中的注意事项尽量使用一次性的加样Tip头，避免交叉污染。定期更换试剂，保证试剂槽的清洁。仪器定期的维护保养与校正。自动化检测系统实习内容检测原理仪器的基本结构仪器基本操作检测项目的临床应用仪器的管理（维护和保养、校准、验证等）质量控制免疫检验自动化是将免疫检验过程

14、中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动化进行。定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，在抗原抗体反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动大，所获取的信号不稳定，定时散射比浊法避开这一阶段，专门测定抗原抗体反应的最佳时段，使检测误差降到最低。小结 速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定方法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成的免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各单位时间内复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1-2min即可完成。定时散

15、射比浊法和速率散射比浊法均有抗原过量检测功能。 电化学发光分析仪是采用电化学发光技术、生物素放大技术、以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺为电子供体，而设计的一种自动化仪器。 吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原，以磁性微粒为固相载体的一种免疫分析法，吖啶酯发光只需加入氧化剂和pH纠正液，不需要酶催化。 酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行定量。小结时间分辨荧光免疫分析仪是用镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，与时间分辨测定技术结合而制造出来的一种自动化分析仪。