牡丹土壤细菌多样性研究现状及进展

1、本科学生毕业论文（设计）题 目 学 院 专 业 学生姓名 学 号 指导教师 职称 论文字数 完成日期 年 月 日牡丹土壤细菌多样性研究现状及进展摘 要:土壤细菌是土壤生态系统的重要组成部分,在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等生物地化循环中起着重要作用。随着人们对生物多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进,土壤细菌多样性,尤其是功能多样性的研究工作逐渐受到生态学家的重视。本文从土壤细菌多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤细菌多样性的研究现状,并对其未来研究方向进行了展望。关键词:土壤;细菌;多样性;展望The current situation and progr

2、ess of peony soil bacterial diversityAbstractSoil bacteria are an important component of soil ecosystem, soil organic matter decomposition and nutrient release, energy transfer and other biological geochemical cycle plays an important role. With the deepening of the peoples understanding of the impo

3、rtance of biodiversity and the continuous improvement of research methods, soil bacterial diversity, especially the functional diversity of research work gradually to the attention of the ecologist. This article from the influence factors of soil bacterial diversity and research methods at home and

4、abroad is expounded the research status of soil bacterial diversity, and the future research direction was prospected.Keyword: soil; bacteria; diversity; prospected.目录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc385414592 摘要 PAGEREF _Toc385414592 h 2 HYPERLINK l _Toc385414593 Abstract PAGEREF _Toc385414593 h 2一

5、. HYPERLINK l _Toc385414594 研究方法 PAGEREF _Toc385414594 h 2 HYPERLINK l _Toc385414595 二.影响牡丹土壤细菌多样性的因素 PAGEREF _Toc385414595 h 3 HYPERLINK l _Toc385414596 2.1.牡丹本身 PAGEREF _Toc385414596 h 3 HYPERLINK l _Toc385414597 2.2土壤类型 PAGEREF _Toc385414597 h 3 HYPERLINK l _Toc385414598 2.3 温度和水分 PAGEREF _Toc385

6、414598 h 4 HYPERLINK l _Toc385414599 2.4 管理方式 PAGEREF _Toc385414599 h 4 HYPERLINK l _Toc385414600 三.研究现状 PAGEREF _Toc385414600 h 5 HYPERLINK l _Toc385414601 四.牡丹土壤细菌多样性研究进展 PAGEREF _Toc385414601 h 5 HYPERLINK l _Toc385414602 4.1新技术新方法的应用。 PAGEREF _Toc385414602 h 5 HYPERLINK l _Toc385414603 4.2各种研究方法

7、有机结合。 PAGEREF _Toc385414603 h 5 HYPERLINK l _Toc385414604 4.3对土壤细菌功能多样性和功能群的研究 PAGEREF _Toc385414604 h 5 HYPERLINK l _Toc385414605 4.4将细菌多样性与地区、区域及全球范围的生态学动态分析结合起来。 PAGEREF _Toc385414605 h 6 HYPERLINK l _Toc385414606 致谢 PAGEREF _Toc385414606 h 6 HYPERLINK l _Toc385414607 参考文献 PAGEREF _Toc385414607 h

8、 6一.研究方法随生化、分子遗传学和分子生物学技术的发展，一些全新的方法应用于土壤细菌研究。这些新的方法对多样性的分析提高到遗传多样性的水平上。有多种行之有效的分子生物学技术（Zhou JZand Tiedje，1995；Holben and Jansson et al.，1988）。除了分子杂交、16SrRNA序列分析外，常用的还有如 RFLPs、RAPD、REPPCR、ERICPCR 等方法。这些分子基因技术能够将那些因为不能被培养而不能用通常方法鉴定的生物种类筛选出来。利用聚合酶链反应（PCR）扩增16SrRNA 的方法最常用到。由于16SrRNA 基因比较保守，通过分析能够基本反映土壤

9、细菌的多样性（Ward and Weller，1990）。其方法步骤可简单概括为，采集土壤样品，在液氮中研磨，提取DNA，得到DNA 粗提物，利用凝胶电泳加微型过滤柱或其他的方法进行纯化。然后将纯化的DNA 作为进行聚合酶链反应的模板，对目标DNA 进行扩增放大并经过电泳检测。用限制性内切酶对克隆产物进行消化，电泳分离，应用分析软件对电泳胶片进行分析，将相同的基因型聚合到一起，各不相同的基因型为惟一的基因型，每一个惟一基因型为一个操作分类单位（OTU）。尽管这项技术不须进行特定生物体的描述，但要弄清楚环境中细菌的数量和联系，特别是与已知序列的基因相似性。而且需要一个大的数据库，也不适合数百个样

10、本的分析（ColwellRRand DLHawkworth，RFLPs 即限制性片段长度多态性。最早Grodzicker 用在adenoviyuses 温度敏感株的突变基因上。其做法一般是通过限制性内切酶识别双链DNA 分子中的特定序列，并在特定位点将DNA 切开。各种原因造成的DNA 的微小改变会造成限制性内切酶识别序列的改变，即消除和产生新的特定酶切位点。另外，大片段的缺失或转移也会造成某些酶切条带的改变。这样对两个个体的DNA 分子特定的酶就会在DNA 不同的位点切割，DNA 分子酶解后，形成不同长度的DNA 片段。这些大小不等的片段通过凝胶电泳时会形成不同的带。用分子探针杂交并利用放射

11、性自显影在感光底片上成像，可找出不同带的位置。作为一种遗传标记，RFLPs具有以下优点：可直接研究基因的组成，其变异比形态学变异更稳定，其表现不受环境条件的影响。而且，这项技术反映的是整个基因组的遗传信息，区分能力更强。RAPD 即随机扩大多态性DNA 技术。其原理是根据DNA 聚合酶链反应技术（PCR），由人工随机合成的DNA 分子为引物，以基因组DNA 为模板，通过基因放大器进行多态性DNA片段的随机合成。如果某一引物分子与某一片段的模板DNA 具有互补的核酸顺序，该引物分子就会结合到单链的模板DNA 上去。在具有四种游离脱氧核糖核苷三磷酸的情况下，通过DNA 聚合酶连接，DNA 链就会从

12、引物3OH 开始接上与模板DNA 分子互补的各种核苷酸，合成一段新的互补DNA 链。对整个基因组的DNA 分子而言，某一引物可能会与单链DNA的许多地方结合。对扩增产物进行电泳、染色分析，就可直接在紫外光线下看到新合成的DNA分子片段形成的带。这种随机放大的多态性DNA 分子就作为分子图谱中的一个位点，将16SrRNA 分析与RAPD 技术结合起来进行研究效果较好。二.影响牡丹土壤细菌多样性的因素2.1.牡丹本身牡丹通过影响土壤有机碳和氮的水平、土壤含水量、温度、通气性及pH值等来影响土壤细菌多样性。牡丹是土壤细菌赖以生存的有机营养物和能量的重要来源, 影响着土壤细菌定居的物理环境, 如牡丹凋

13、落的花瓣的类型和总量、水分从土壤表面的损失率等。牡丹的存在有利于增加土壤细菌多样性和细菌生物量；反之, 牡丹的破坏可能改变细菌组成并降低细菌多样性。Zak等(2003) 采用PLFA 方法研究了牡丹种类多样性与土壤细菌的关系, 结果表明PLFA 的含量与植物种类数量相关性显著, 随着植物多样性的增加, 土壤中细菌和放线菌的PLFAs 数量降低, 而真菌的PLFAs 却增加。Johnson 等(2003) 的研究表明, 在北美草原, 可能由于土壤中的菌根真菌对不同植物的影响不同, 使得牡丹多样性发生变化.2.2土壤类型近年来大量实验都证明了土壤类型是土壤细菌群落结构和密度的主要影响因素(Chia

14、rini et al., 1998；Gelsomino et al., 1999; Da Silva et al., 2003) 。Yang 等(2000) 研究了土壤有机碳与土壤细菌功能多样性的关系, 结果表明, 两者之间存在明显的相关性, 维持土壤有机碳含量对保持细菌多样性很重要。Sessitsch等 (2001) 用T-RFLP 技术研究了长期不同施肥条件下的土壤颗粒中细菌多样性, 结果表明土壤颗粒越细小, 有机质含量越高, 土壤颗粒中的细菌群落结构越复杂, 多样性越高。Staddon 等(1998) 对加拿大西部不同气候带的土壤细菌多样性和结构进行了研究, 结果表明土壤细菌功能多样性与

15、土壤pH值呈正相关, 但随纬度增加而降低。ODonnell 等(2001) 研究也发现, 土壤pH值是影响土壤细菌多样性的重要因子。2.3 温度和水分温度和水分对土壤细菌多样性的影响存在交互性, 具有协同效应(周才平和欧阳华, 2001), 因此可以用季节的概念来说明不同温度和水分对细菌多样性和活性的影响(Papatheodorou et al., 2004) 。例如, Liu等(2000) 用Biolog 分析方法证明, 在美国新墨西哥州北部Chihuahuan 沙漠牧场中细菌的功能多样性在夏季最高, 春季最低；在夏季干旱试验区比在夏季和春季的对照中更低；Lipson和Schmidt(200

16、4) 对高山冻土土壤细菌群落的研究结果表明, 细菌群落结构组成具有季节性变化规律；Schadt等(2003) 对苔原冻土土壤中真菌群落结构的研究表明, 从冬季到夏季, 子囊菌(Ascomycota) 所占比例下降, 担子菌(Basidiomycota) 和结合菌(Zygomycota) 比例上升。Nemergut 等(2005) 对高山和北极地区土壤细菌的研究综述中指出, 夏季温度高, 植物代谢旺盛, 向土壤中释放一些根际分泌物而刺激细菌繁殖；到了秋季植物停止生长, 细菌以能利用植物凋落物的真菌为主；再到了冬季, 适寒性细菌则大量繁殖。2.4 管理方式土壤的管理方式包括农药的应用、施肥、耕作方

17、式等, 这些人为的影响因素通过改变土壤的理化性质而影响细菌多样性。农药包括除草剂、杀真菌剂和杀虫剂等, 不同农药对土壤细菌的影响不同, 可能对土壤细菌产生不同程度的抑制作用, 也可能使土壤细菌多样性和生物量减少, 还可能使土壤细菌群落结构和功能发生改变( 钟文辉和蔡祖聪, 2004a) 。Fantroussi 等(1999) 研究了经敌草隆(diuron)、利谷隆(linuron) 和绿麦隆(chlorotoluron)3 种脲除草剂处理10年后的土壤中细菌群落的变化, 结果表明, 使用除草剂后, 土壤细菌多样性降低, 其群落结构和代谢能力受到明显影响；Sigler和Turco(2002) 用

18、PCR-DGGE法对杀菌剂百菌清在草坪、森林和农业土壤上的应用研究结果表明, 百菌清使土壤细菌和真菌的群落结构都发生改变；杀虫剂也可能影响土壤细菌多样性和活性, 如Yang 等(2000) 对杀虫剂triadimefon 的研究表明, 杀虫剂在DNA水平上影响土壤细菌群落多样性, 且受杀虫剂污染的土壤的有机碳含量和细菌生物量中碳含量都较低。施肥对土壤细菌多样性及活性的影响非常复杂, 可能与肥料的种类、施用方式(施用量、长期施用或短期施用)、土壤类型和利用方式等因素有关。Marschner 等(2001) 的实验结果表明, 长期施用有机肥使得G+/G 和细菌/真菌的比例提高, 细菌和真核细菌群落

19、多样性受土壤有机碳和C/N比的影响；而Sun等(2004) 的实验结果则是：自然的和经过有机肥处理的土壤细菌群落多样性相似, 但是与化肥处理的差异明显, 石灰处理对多样性的影响较小。Sarathchandra 等(2001) 认为无机氮肥和磷肥对土壤细菌多样性无明显影响。土地耕作方式包括传统耕作、免耕、连作、轮作等, 不同的耕作方式会对土壤细菌多样性造成不同的影响。三.研究现状由于技术手段的限制，传统上人们往往认为细菌的地理分布与大型动植物的分布有着根本区别，即细菌是全球性随机分布的。随着分子生物学技术在细菌生态学研究中的应用，近年来发现土壤细菌群落结构和多样性同样具有一定的地理分布格局，颠覆

20、了人们传统上对于细菌全球性随机分布的认识。这些研究证明了细菌的分布在空间上是非随机的，却仍没有回答细菌的这种非随机分布是如何产生和维持的，即哪些因子驱动了细菌多样性的空间分布特征.近日，中科院生态环境研究中心贺纪正课题组有关大尺度下土壤细菌多样性变化驱动机制的研究取得重要成果，论文发表于Nature系列杂志国际细菌生态学会会刊（The ISME Journal）上（Differences in soil bacterial diversity: driven by contemporary disturbances or historical contingencies? The ISME J

21、ournal (2008) 2, 254264）。他们采用分子生物学技术，结合先进的统计分析方法，对大量土壤样品细菌多样性特征进行了系统分析，发现历史进化（以地理上分隔的不同取样点或土壤类型、土壤剖面层次来表征）是驱动大尺度下（约1000公里）土壤细菌多样性变化的主控因子，其对土壤细菌多样性变化的贡献约为60%；当代环境扰动（以不同的取样时间和施肥处理来表征）也可造成局部土壤细菌多样性变化，其对土壤细菌多样性变化的贡献约为20%；另有约20%的贡献来自于该研究尚未考察到的因子。这一研究首次在大尺度下对土壤细菌多样性的变化给出了定量表征，并为开展类似的土壤细菌生物地理学研究提供了方法思路。该项研

22、究成果表明，历史进化和现代环境扰动对土壤细菌多样性变化的作用模式与大型动植物有相似之处，可能有一些对所有类型生物都适用的生物地理分布规律存在.四.牡丹土壤细菌多样性研究进展随着人们对土壤细菌多样性研究的不断深入, 今后的研究工作将集中在如下四个方面：4.1新技术新方法的应用。随着分子生物学技术的发展, 目前的新型技术如DNA芯片技术、环境全基因组测序技术和稳定同位素标记技术等, 为土壤细菌多样性研究提供了新的方法, 从而能将细菌在基因层面上所发生的变异与环境因子相结合, 为土壤细菌多样性功能与生态系统平衡以及各功能群落结构之间关系的研究提供有力的支持。4.2各种研究方法有机结合。目前对单一方法

23、的研究已经基本成熟, 今后有必要加强对各种研究方法的灵活应用, 根据各种方法的优缺点将其有机结合, 取长补短, 消除单一方法的误差, 提供更加全面准确的细菌多样性变化信息。4.3对土壤细菌功能多样性和功能群的研究。土壤细菌功能多样性与土壤功能关系密切, 土壤细菌功能多样性是土壤功能的保证, 同时也是恢复土壤功能的基础。迄今为止, 研究较多的功能多与C、N、S等元素的物质循环和污染物降解过程相关, 其他生态过程(例如磷循环)的相关功能研究结果则很少。而细菌多样性研究的一个明显的趋势是将细菌的功能多样性提到了更为突出的位置, 在物种尺度之上, 更强调功能群的划分, 围绕某一土壤生态功能群开展研究正

24、成为土壤生物多样性研究的重要趋势4.4将细菌多样性与地区、区域及全球范围的生态学动态分析结合起来。目前人们所能了解的详细的群落多样性信息大部分来自于几类易于研究的群落类型如农田、森林、草地生态系统, 岩岸潮间带, 温带湖泊等。而对其他类型群落及其相互作用结合起来进行研究, 将为我们了解细菌群落结构的普遍模式提供重要帮助。因此, 细菌多样性与地区、区域及全球范围的生态学动态分析相结合; 扩大细菌多样性研究的群落范围将成为未来细菌多样性研究的热点。致谢衷心感谢我的导师，她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。导师学识渊博，品德高尚，平易近人，在我学习期间不仅传授

25、了做学问的秘诀，还传授了做人的准则，这些都将使我终生受益。在我毕业论文的写作过程中，老师始终给予我精心的指导和不懈的支持。她循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。在此谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。同时，我也要向身边的同学表示感谢，因为论文中某些观点提出和他们的讨论是分不开的。路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。我愿在未来的学习和研究过程中，以更加丰厚的成果来答谢曾经关心、帮助和支持过我的老师和同学。参考文献1.夏北成1998牡丹对土壤细菌群落结构的影响应用生态学报，9（3）：2963002陈华癸，陈文新等1981土壤细菌学上海科学出版社3. 刘润进等1995野生植物菌根菌的初步调查

26、莱阳农学院学报，12（2）：1251284.Lijbert，Brussaard1997土壤中的生物多样性与生态系统功能Ambio，26（8）：5555625.Angert E. R., K. D. Clements and N. R. Pace. 1993. The largest bacterium. Nature, 362: 2392416.Bakken, L. R. 1985. Separation and purification of bacteria from soil. Appl. Environ. Microbiol., 49:148214877.Borneman, J., P. W. Skroch, K. M. OSullivan, J. A. Palus, N. G. Rumjanek, J. L. J. Nienhuis, and E. W. Triplett.8.1996. Molecular microbial diversity o