多重脑震荡对大鼠认知行为及多巴胺能神经元的影响

1、多重脑震荡对大鼠认知行为及多巴胺能神经元的影响【摘要】目的讨论多重脑震荡()大鼠认知行为及多巴胺(DA)能神经元的变化。方法用金属单摆打击装置复制大鼠模型，动物随机分为对照组和伤后124d6个损伤组;应用rris水迷宫实验，评价大鼠学习记忆功能，用免疫组化结合图像分析方法，研究伤后中脑黑质致密区(SN)、腹侧被盖区(VTA)DA能神经元变化，并在光镜下对酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞进展计数。结果在水迷宫测试中，伤后16d组大鼠逃避寻找平台的时间明显延长;在无平台探测实验中，伤后8、16d组大鼠在原有平台第三象限停留时间明显减少。在免疫组化实验中，SNDA能神经元表达在伤后4、8d组明显升高;V

2、TA在2、4、8、16d组明显升高(P0.05)。结论多重脑震荡大鼠出现较为严重的认知行为障碍;伤后大鼠SN、VTADA能神经元表达出现不同程度的增高。【关键词】多重脑震荡;rris水迷宫;多巴胺;大鼠脑震荡的发生率高、后遗症多1，2。目前，国内、外对单纯脑震荡动物的认知行为研究较多，但对运动医学界常见的多重脑震荡及与之相关的认知行为的实验研究尚缺乏报道。曾有学者采用液压冲击复制屡次脑损伤模型3，4，但该方法要求动物处于麻醉状态而非清醒状态，不能确切地用来研究运动相关脑震荡的损伤特征和损伤机制。本研究通过复制多重脑震荡大鼠模型，应用rris水迷宫测试，采用免疫组化方法对伤后中枢DA能神经元的病

3、理变化进展分析,从而评价大鼠多重脑震荡后的空间学习记忆功能，讨论多重脑震荡对大鼠认知行为的影响。1动物与方法1.2方法1.2.1多重脑震荡大鼠模型的建立及标准控制完全清醒的SD大鼠固定在自制铁质单摆式脑损伤复制仪上，摆锤上举使初始角达100110摆锤自由下落，撞击在大鼠顶枕部，复制具有一过性脑功能障碍的脑震荡大鼠。打击后，观察大鼠恢复自主呼吸的时间及各种反射情况，并严格参照单纯脑震荡判断标准5,每天同一时间复制大鼠单纯脑震荡一次，连续三天重复上述操作而获得多重脑震荡模型。1.2.2分组将48只大鼠按随机数据表分组，分为伤后1、2、4、8、16、24d组，共6个损伤组(每组n=8)。同时设一正常

4、对照组(n=8)。1.2.3大鼠rris水迷宫测试对多重脑震荡组大鼠于伤后第121天连续进展rris水迷宫测试，包括水下平台、水上平台试验及无平台探测实验,详细方案参见于建云等5的方法。1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件对数据进展处理，所有结果用xs表示,并采用单因素方差分析方法进展分析。2结果2.1rris水迷宫测试结果在逃避埋伏期实验中，伤后8d组(即伤后第17天)和24d组(即伤后第1521天)大鼠rris水迷宫测试时间延长不明显(P0.05，见表1)。伤后16d组(即伤后第814天)大鼠在水迷宫测试中逃避寻找平台的时间明显延长，尤其在16d组的隐匿平台逃避埋伏期的第9、10天

5、和可视平台逃避埋伏期的第13、14天更为显著(P0.05，见表1)。在无平台探测实验中，伤后8、16d组大鼠在原有平台第三象限停留时间明显减少(P0.05)，也即在第7天和第14天的无平台探测实验中，大鼠对空间记忆的保持情况有明显影响;伤后24d组大鼠在原有平台第三象限停留时间稍减少(P0.05，见表2)。表1各组动物隐匿平台逃避埋伏期、可视平台逃避埋伏期变化表2对照组与后各组无平台探测实验中各象限时间变化与对照组比拟：1)P0.05转贴于论文联盟.ll.2.2伤后不同时间点相关脑区DA能神经细胞计数结果在SNDA能神经纤维内酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数以伤后1d开场升高，8d到达顶峰，与对

6、照组相比4、8d组有显著性差异(P0.05);与对照组相比，VTA2、4、8、16d组有显著性差异(P0.05)，4d组TH阳性细胞数到达顶峰，24d组根本恢复(见表3)。2.3伤后不同时间点相关脑区DA能神经细胞表达结果在SN以伤后1d开场升高，4、8d组与对照组相比有显著性差异(P0.05)，24天组根本恢复。与对照组相比，VTA2、4、8、16d组有显著性差异(P0.05)，2d组阳性反响最强(P0.01)，24d组根本恢复(见表4)。表3各组中脑SN、VTADA能神经细胞数的变化与对照组比拟：1)P0.01，2)P0.05表4各组中脑SN、VTADA能神经细胞灰度值的变化与对照组比拟：

7、1)P0.01,2)P0.053讨论3.1后不同时间点的认知行为学测试及意义rris水迷宫是英国心理学家RihardG.rris1981年创造并应用于学习记忆脑机制研究的，此模型被广泛应用于啮齿类动物的学习记忆研究中。实验时，大鼠在特定的水池中，出于求生的本能寻找一立足地。在水面下一固定位置有一个隐藏的平台，大鼠只有找到平台才能获救。在这样一个逃避性学习过程中，假如大鼠找到水下平台的时间越长，说明其空间记忆才能越差;大鼠经水下和水上平台学习强化后，在探测性试验中去掉平台，假如大鼠有良好的空间学习记忆才能，就会在原平台所在区域停留较长的时间。本实验中，后814d大鼠逃避寻找平台的时间明显延长，尤

8、其在后水下隐匿平台测试的第9、10天和水上可视平台的第13、14天，与对照组相比，差异具有显著性，提示大鼠学习记忆功能受损严重。在8d组的无平台探测试验中(即第7天)和16d组的无平台探测试验中(即第14天)，在原有平台象限(第象限)停留时间与对照组相比明显减少，差异具有显著性，提示大鼠对空间记忆的保持情况有严重的影响。因此，水迷宫测试结果说明，后大鼠出现中期(伤后714d)学习记忆功能障碍，而对早期(伤后16d)无明显影响。以上rris水迷宫测试提示，后大鼠出现中期(伤后714d)学习记忆功能障碍，而对早期(伤后16d)无明显影响。大鼠在rris水迷宫实验中，表现为伤后较长时间的空间认知行为

9、障碍，可以推测这与其屡次受损导致损伤累积作用有关。3.2后不同时间点相关区DA能神经元的变化及意义文献资料显示，创伤性脑损伤对TH表达具有一定的影响。Yan等6，7运用控制性皮层冲击造成TBI模型，用免疫组化和免疫印迹法检测伤后28d后TH表达情况，免疫组化结果显示纹状体的TH表达升高，免疫印迹结果显示前额叶皮质的TH表达明显升高。吴春云等8运用金属单摆式打击装置复制脑震荡大鼠模型，应用免疫组化方法检测前额叶皮质的DA能神经纤维。发现伤后TH阳性纤维的密度增加、反响增强，伤后4d到达顶峰，之后逐渐下降，直至伤后24d仍显著增高。本研究显示，后脑SNTH阳性反响以伤后1d开场升高，8d到达顶峰，与对照组相比4、8d组有显著性差异;而VTA2、4、8、16d组有显著性差异，以4d组TH阳性反响到达顶峰，24d组根本恢复。本实验中后阳性产物表达急剧升高，可能与后神经元的应激反响有关。文献资料说明9，脑损伤时作用于神经系统的瞬间机械暴力到达一定程度，导致广泛的神经元过度兴奋，造成a2+处于超载状态。在ATP、g2+存在下，神经元内TH活性可被a2+激活