丹参对糖尿病肾病大鼠肾脏水通道蛋白2表达的影响

1、丹参对糖尿病肾病大鼠肾脏水通道蛋白-2表达的影响【摘要】目的讨论肾脏水通道蛋白-2(AQP-2)的表达与糖尿病肾病大鼠水液代谢异常及丹参防治作用的机制。方法60只安康SD大鼠分为正常组(10只)，剩余50只采用高糖高脂饲料刺激加小剂量STZ诱导糖尿病大鼠模型成功30只，随机分为模型组、对照组、观察组每组各10只；免疫组织化学检测AQP-2在各组大鼠肾脏中的分布及蛋白质的表达；RT-PR方法检测各组大鼠AQP-2RNA的表达，并以-atin相对定量。结果肾脏免疫组化显示，AQP-2主要在肾脏的集合管表达。在4组动物的肾脏AQP-2蛋白质相对阳性面积：正常组(0.1190.035)，模型组(0.1

2、880.027)，对照组(0.1580.036)，观察组(0.1540.033)和RNA正常组(0510004)，模型组(0.810.059)，对照组0.780.090，观察组0.700.027的表达上观察组较模型组均下调P0.01。结论在糖尿病模型大鼠肾脏组织中AQP-2表达增多，AQP-2的增多可能参与了糖尿病多尿的形成。丹参对水通道蛋白的表达有下调作用，这可能是其利水作用的机制，也是其防治糖尿病肾病的基矗【关键词】糖尿病肾病；水通道蛋白；丹参；链脲佐菌素糖尿病肾病diabetinephrpathy,DN是糖尿病diabetesellitus,D最常见的微血管并发症，是糖尿病患者主要的死亡

3、原因之一。DN的根本病变是细胞外基质(Extraellularatrix，E)在肾小球、肾小管积聚导致肾小球基底膜增厚和系膜基质增多，出现结节型与弥漫型肾小球硬化。本研究观察丹参对STZ实验性糖尿病大鼠AQP-2蛋白程度和基因程度的表达、尿白蛋白排泄率的改变，旨在讨论AQP-2的表达改变与糖尿病肾病水液代谢异常的关系以及丹参的调节效应，为DN的预防、治疗提供实验根据。1材料实验动物选用4周龄雄性SPF级SD大鼠第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SXK(军)2002-005)60只，体质量为(16512.5)g。SPF级饲养环境，环境温度为225，12/12h昼夜规律，按每笼5只喂养。2方

4、法2.1动物分组及糖尿病模型的建立随机将大鼠分为2组：正常组10只；糖尿病造模组(D)50只；正常组进食普通饲料。糖尿病模型组进食高糖高脂饲料，即普通饲料中参加10的猪油、10的葡萄糖、1的胆固醇、2的蛋黄粉、0.2的胆酸钠。糖尿病造模组大鼠在高糖高脂饲料喂养4周后尾静脉注射低剂量STZ(30gkg，Siga公司)1次。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗以及典型的糖尿病肾病改变等特点1。以注射后1个月血糖值持续高于7.8lL，尿糖、尿蛋白阳性者为模型建立成功，共选出成模动物30只，随机分到模型组，对照组和观察组3个组中，每组10只成模率为60。2.2动物的给药及饲养灌胃剂量按大鼠用药剂量

5、为人的10倍计算。对照组：每日灌服格列吡嗪5gkg；观察组：每日灌服丹参5.5gkg。正常组和模型组灌服等体积的蒸馏水。实验期间，正常组动物自由饮水，标准饮食，模型组、治疗组、观察组动物给予高糖高脂饮食，自由饮水。2.3肾脏组织的留取实验第16周末时，用25%乌拉坦麻醉大鼠，翻开腹腔,从腹主动脉取血,充分暴露手术视野在腹腔的两侧找到肾脏，将部分标本迅速放入4多聚甲醛中固定，用于石蜡切片。余下部分用消毒铝箔包好迅速放入液氮中，保存于-80冰箱中，备用于总RNA的提龋2.4肾脏组织学分析肾组织HE染色。镜下观察肾脏组织的一般形态构造，肾小球、肾小管、间质有无组织学异常。2.5免疫组织化学肾组织免疫

6、组织化学染色(试剂盒均购自武汉博士德生物工程)。按照免疫组化试剂盒操作步骤进展加样,以SAB法进展检测。先滴加150稀释的AQP-2一抗，4过夜。滴加试剂2(羊抗鼠IgG)，室温放置30in。再滴加试剂3(SAB)，室温放置30in。最后DAB显色。细胞浆中呈现棕黄色颗粒为阳性反响，图像采用iaspr图像分析系统分析。所有切片放大倍数为1000。每组取6只动物，每只动物AQP-2染色各取2张切片，观察3个视野。视场面积为4800002，测定阳性面积比Aa(%)(阳性面积视野面积)。表1AQP2的表达Aa(%)(阳性面积比)和24h尿蛋白排泄率(略)转贴于论文联盟.ll.2.6逆转录一聚合酶链式

7、反响(RT-PR)总RNA提取:采用TaKaRa公司消费的一步法提取总RNA试剂盒，按照试剂盒说明书取200g肾脏组织进展操作提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度，RNA浓度=D260n-D280n稀释倍数0.04g/l，并用D260/D280计算RNA污染程度R，R在1.82.0之间;RNA浓度计算：RNA浓度=A260值40gl50；RT(逆转录)：AQP-2引物(由宝生物工程大连合成)，上游：5-GTTTTTGTTTTTTGG-3，下游：5-GGTGAGGGGAAAGAGGTA-3。-atin引物合成：上游：5-TTTGGGTATGGAATT-3，下游：5-GGAGAATGATT

8、TGATTT-3;逆转录反响：按照试剂盒说明书进展DNA逆转录反响，逆转录反响参加试剂含25l/Lgl22l、10RTBuffer1l、RNaseFreedH23.75l、dNTPixture各10l/L1l、RNaseInhibitr40U/l0.25l、AVReverseTransriptase5U/l0.5l、特异性下游引物20pl0.5l、提取总RNA样本1.0l作为模板，总体积10l，反响条件为4230in、955in、55in一个循环，-20保存备用；扩增半定量多聚酶链反响：反响条件95预变性3in，9445s、6040s、7245s30个循环，最后一个循环72延伸3in。扩增完毕

9、后20g/L琼脂糖凝胶检测，在紫外灯下观察结果并拍照保存，BI-RAD凝胶成像分析系统(BI-RAD公用)采集图像并进展分析。PR检测结果以经-atin校正后的A值表示。ark为TaKaRa公司的DNAarkDL2000。2.7统计学处理实验数据以s表示。SPSS10.0统计软件进展分析，采用ne-ayANVA法进展方差分析。两两比拟时根据其方差是否齐性选择LSD方差齐性或Dunnett方差不齐方法。P0.05表示有统计学意义。3结果3.124h尿蛋白排泄率状况模型组大鼠24h尿蛋白排泄率最高。动物的24h尿蛋白排泄率较模型组明显降低，模型组、对照组和观察组24h尿蛋白排泄率均高于正常组。3.

10、2大鼠肾脏的病理改变肾脏的HE染色可见对照组大鼠为正常的肾脏组织构造，模型组肾脏损害为片状分布，以髓袢偏髓质的近曲小管为主的上皮细胞空泡状变性、肿胀，肾小球内可见红细胞淤积，病变严重的部位肾小管上皮细胞脱落。对照组上皮细胞空泡状变性较模型组轻，但肾小球内红细胞淤积未见改善，观察组上皮细胞空泡状变性较模型组轻，肾小球内少见红细胞淤积的情况，肾小管未见上皮细胞脱落。3.3AQP-2在肾脏的蛋白质表达对大鼠肾脏的免疫组织化学染色结果提示,AQP-2蛋白在肾脏的集合管表达,而在肾小球和肾间质未见表达,与已往报道一致2。模型组大鼠肾脏AQP-2蛋白的免疫组化染色结果显示,沿集合管内壁上皮细胞分布的棕黄色

11、颗粒比对照组明显颜色加深而浓重,分布面积更广泛。上述结果说明模型组大鼠肾脏AQP-2在蛋白质程度上表达增强。对照组和观察组AQP-2的棕黄色程度比模型组要浅的多P0.05，结果见图1及表1。3.4大鼠肾脏AQP-2RNA的表达RTPR产物电泳结果显示,模型组大鼠肾脏髓质AQP2RNA的表达明显高于正常组,分别为0.810.059和0.510004(P0.01)。观察组0.700.027明显低于模型组(P0.05)，为该结果与肾脏AQP-2免疫组织化学的结果相一致。结果见图2。4讨论AQP已被证实是一组对水有高度选择性的细胞膜转运蛋白，是跨膜水运的重要通道，这为研究糖尿病肾病水代谢的异常提供了新

12、的角度。目前研究说明，尿液浓缩稀释功能由肾脏集合管主细胞的AQP-2来完成，而AQP-2的表达主要受加压素(antidiuretihrnevaspressin，AVP)的调节。AVP与肾脏集合管主细胞基底膜上的AVPV2受体结合后，使细胞内AP浓度升高，激活PKA，将AQP-2蛋白磷酸化，使之从囊泡穿梭到管腔膜，从而进步集合管对水的通透性3，同时该信号通路激活REB元件，刺激AQP-2的合成，表现为AQP-2RNA和蛋白程度的进步，从而实现AVP的抗利尿作用。既往研究说明在D大鼠中血AVP程度升高4，这可能与水钠潴留有关。从理论上讲,D大鼠血浆浸透压升高,刺激VP分泌增加,促进肾小管对水的重吸

13、收,以降低血浆浸透压,同时进步尿浸透浓度,尿量减少。而实际上对于D大鼠来说,这种负反响机制在早期处于代偿状态,VP代偿性升高,在晚期那么处于失代偿状态,尽管有回吸收水分的倾向,但尿量仍然增加。VP对AQP2的调节包括短期调节和长期调节,本研究中D大鼠AQP2的RNA表达增加,促使AQP2合成增加,导致水通透性增加,尿量增加,应属于长期调节。祖国医学所认识的消渴病日久出现的“水肿“胀满“尿浊“关格与现代医学的糖尿病肾病的临床病症相似。丹参之脂溶性成分包括丹参酮、水溶性成分丹参素、原儿茶醛、丹参酚酸B，研究证实丹参增加肾血流、有利尿和抗炎作用，可降低血BuN、Sr，调节肾组织部分微循环，改善肾功能。临床观察证实，丹参在改善早期DN患者的水肿、血液流变学等病症、降低FPG、BuN、UAER、Sr上都有很好的疗效5，6。孙兴隆等7研究发现，丹参酮可抑制肾成纤维细胞增殖，降低细胞内胶原合成率。本研究结果说明丹参能显著降低糖尿病肾病大鼠24h尿蛋白排泄率。病理提