壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究

1、壳聚糖纳米粒基因载体的制备和体外转染实验研究【摘要】目的制备基因载体壳聚糖纳米粒，研究其构造特征及其体外对细胞的转染活性。方法以复凝聚法制备壳聚糖-pDNA纳米粒;电镜测定其形态、粒径;凝胶电泳阻滞实验观察壳聚糖和pDNA的结合力;紫外可见分光光度计测定其负载力、负载率;体外转染入人胚肾细胞293T，荧光显微镜观察转染效率，K8法评价细胞毒性。结果壳聚糖-pGFP纳米粒多呈球形，直径为(13248)n;凝胶电泳阻滞实验示pGFP被完全包裹在纳米粒内;其负载力(L)为(48.22.0)%，负载率(LE)为100%;体外转染实验证明壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染293T细胞并在细胞中表达

2、绿色荧光蛋白;壳聚糖-pDNA抑制率(26.084.28)%。结论采用复凝聚法制备的壳聚糖-pDNA纳米粒可有效转染至细胞内，但有一定的细胞毒性。【关键词】壳聚糖;纳米粒;基因载体;转染Abstrat:bjetiveTpreparehitsannanpartilesasgenevetrssastinvestigatethEirstruturalharateristisandell-genetransfetineffiienyinvitr.ethdsThehitsan-pDNAnanpartileserepreparedbyaplexaervatinethdandthEIrrphlgyasell

3、asthepartilediaetererebservedundertheeletrniirspe.ThebindingfpDNAasevaluatedbyagarsegeleletrphresisanalysis;theladingapaityandladingeffiienyeredeterinedithUV/Visspetrphteter.Thetransfetinexperientsereperfredithhuanebrynikidney293Telllineinvitr.Thetransfetineffiienyaseasuredunderfluresentirspe.Theytt

4、xiityasbservedithelluntingKit-8(K-8).ResultsThehitsan-pDNAnanpartilesereainlyspherial,ithanaveragediaeterf(13248)n.TheagarsegeleletrphresisanalysisnfiredtheDNAashllyenapsulatedinthenanpartiles.Theladingapaityas(48.22.0)%andladingeffiienyas100%.Transfetininvitrprvedthathitsan-pDNAaseffiientin293Tells

5、andtheexpressinfgreenfluresentprteinsasbservedunderfluresentirspe.Theinhibitinperentagefnanpartilesas(26.084.28)%.nlusinsThehitsan-pDNAnanpartilesanbeeffetivelytransfetedintells.AertaindegreefyttxiityasbservedbyK8,thugh.Keyrds：hitsan;nanpartiles;genevetr;transfetin基因治疗为近年研究热点，高效低毒的载体为基因治疗的关键1。壳聚糖作为一

6、种聚阳离子基因载体，是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺构成的生物共聚物，有较好的生物相容性和生物可降解性，免疫原性低，毒性小;而且壳聚糖易于和带负电荷的DNA形成纳米级复合物，能有效保护DNA免受核酸酶的降解2。目前被认为是很有潜力的基因递送载体3。本研究以壳聚糖作为载体，制备壳聚糖-pDNA纳米粒，观察其构造特征，并在细胞程度上测定其转染效果。1材料和方法1.1材料壳聚糖(分子式：12H24N29,分子质量：340)购自Siga-Aldrih公司，脂质体Lipfetaine2000购自Invitrgen公司，293T人胚胎肾细胞购自中科院上海细胞库，表达绿色荧光蛋白的质粒PGPU6/GFP/Ne-

7、shN购自上海吉玛公司，elluntingKit-8(K-8)购自日本同仁化学研究所。1.2方法1.2.1细胞培养293T人胚胎肾细胞培养于含10%新生牛血清、1108U/L青霉素、100g/L链霉素的RPI1640+HEPES培养液中，置于37、5%二氧化碳培养箱培养。每35天按1315的比例进展传代。1.2.2壳聚糖-质粒(pDNA)微粒体的制备(复凝聚法)取壳聚糖500g，溶解于1%乙酸溶液，浓度0.5%(pH4.5)，超声震荡至澄清，121，高压灭菌20in备用。pDNA溶解于灭菌20%Na2S4溶液中，浓度为25g/L。取0.5%的壳聚糖与等体积的pDNA溶液混合，在漩涡混合器上充分

8、混匀后，12000r/in、4离心20in，沉淀物以PBS重悬，此为壳聚糖-pDNA微粒混悬液。1.2.3壳聚糖-pDNA纳米粒的形态和粒径测定取少量壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液，滴至铺有碳膜的铜网上，静置2in，用滤纸吸干混悬液，再滴加1%(/V)磷钨酸复染2in，于透射电子显微镜下观察微粒形态并拍照。1.2.4壳聚糖-pDNA纳米粒凝胶电泳阻滞实验分别取裸pDNA液、壳聚糖-pDNA混悬液、壳聚糖液及制备壳聚糖-pDNA混悬液离心后上清液20l，以1%琼脂糖凝胶程度电泳实验。1.2.5壳聚糖包封pDNA测定将制备的壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液尽可能吸尽上清液，冻干、称重，标记为0。搜集上清

9、液，UV法在波长260n处测定上清液未结合pDNA浓度，标记为s。将制备微粒时pDNA参加量记为pDNA。按以下公式计算负载力(ladingapaity,L)及负载率(ladingeffiieny,LE)：L=(pDNA-s)/0100%,LE=(pDNA-s)/pDNA100%。1.2.6体外转染实验将293T细胞接种于6孔板，每孔接种6105个细胞，继续培养细胞约24h(细胞交融60%70%)，使细胞达对数生长期，进展转染实验。设立壳聚糖-pDNA孔、脂质体Lipfetaine2000阳性对照孔、阴性对照孔、空白孔，每组设3个复孔。吸尽旧培养基，将壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液500l(质粒

10、2.5g/孔)参加壳聚糖-pDNA孔中，同时制备500l脂质体-pDNA复合物参加阳性对照孔中，阴性对照孔中放入500l壳聚糖悬液，再每孔参加1.5l无血清培养基。十字摇匀法混匀，放回2培养箱孵育，46h后换成有血清的培养基。2472h，荧光显微镜观察细胞内绿色荧光。1.2.7K8实验取对数生长期293T细胞接种于96孔板,每孔1104个细胞，细胞交融至60%70%时进展转染。设壳聚糖-pDNA孔、脂质体-pDNA孔、壳聚糖孔、空白孔。转染方法同前，质粒为0.1g/孔，每组设5个复孔。培养48h后，每孔加K-8试剂10l,再培养4h。在酶标仪进展双波长测定，波长450490n，参比波长6006

11、50n，测D值。实验重复3次。细胞存活率=(D试验组-D空白组)/(D对照组-D空白组)100%，细胞生长抑制率(IR)=(1-细胞存活率)100%。1.3统计学处理定量资料用SPSS13.0统计软件处理，数据以s表示，2组间比拟采用t检验，多组间比拟采用单因素方差分析(ANVA)。设检验水准：=0.05。2结果2.1壳聚糖-pDNA纳米粒的形态和粒径透射电子显微镜观察结果说明，壳聚糖-pDNA纳米粒多呈球形(图1)，按放大倍数计算，微粒直径在100200n之间，平均约(13248)n。图1壳聚糖-pDNA纳米粒电镜照片(20000)2.2壳聚糖-pDNA纳米粒凝胶电泳阻滞实验凝胶电泳阻滞实验

12、结果如图2。壳聚糖-pDNA纳米粒能阻滞pDNA向阳极挪动，使pDNA滞留于加样孔中而发亮，说明pDNA与壳聚糖之间通过静电作用有效凝聚。壳聚糖孔和离心后上清液孔均未见到发亮的pDNA。图2壳聚糖-pDNA纳米粒凝胶阻滞实验1.裸pDNA;2，3.壳聚糖-pDNA纳米粒;4.壳聚糖;5.离心后上清液;6、7.DNAarker2.3壳聚糖包封pDNA测定应用UV法测定上清液中未结合pDNA浓度，在260n处为负值，pDNA浓度为负值，经计算壳聚糖L为(48.22.0)%，LE为100%，说明壳聚糖完全包封pDNA。2.4体外转染实验转染24h观察，脂质体质粒转染组有散在的绿色荧光点，壳聚糖质粒组

13、无荧光点。48h时观察，脂质体组荧光明显增多，亮度增加，壳聚糖质粒组散在绿色荧光，亮度弱，局部细胞脱壁死亡(图36)。72h观察荧光均减少，壳聚糖质粒组死亡细胞增多，脂质体质粒组细胞状态根本正常。荧光显微镜观察48h时转染率最高。壳聚糖-pDNA纳米粒组转染率(4.252.26)%，脂质体转染率(33.657.16)%(P0.05)。2.5K8实验壳聚糖-pDNA抑制率(26.084.28)%、脂质体-pDNA抑制率(8.664.25)%、壳聚糖组抑制率(16.93.59)%，壳聚糖-pDNA组抑制率与脂质体-pDNA组相比有明显差异(P0.05)。壳聚糖也有抑制细胞生长作用。转贴于论文联盟.

14、ll.3讨论壳聚糖是一种弱碱性的天然高分子多聚糖，在酸性条件下溶解，荷正电,能通过静电作用结合带负电的pDNA分子,因为细胞外表带负电荷，其复合物被细胞通过静电作用摄龋根据壳聚糖的这些特点，本实验以复凝聚法制备了壳聚糖-pDNA纳米粒，对其相关指标进展检测，其直径在100200n，小于细胞膜的孔径，利于细胞顺利摄龋凝胶电泳阻滞实验和负载力，负载率的测定证明pDNA完全被壳聚糖包裹。壳聚糖-pDNA纳米粒的构建是成功可行的。本实验的体外基因转染以转染效率较高的293T为靶细胞，通过壳聚糖转染pEGFP，结果显示荧光显微镜下细胞内可观察到绿色荧光，说明纳米粒能将绿色荧光蛋白基因递送到细胞内，成功转

15、染并表达绿色荧光蛋白。有研究说明壳聚糖在体内和体外有较好的转染效果4-6，Sat等7发现，当壳聚糖相对分子质量为15或52kDa，质粒：壳聚糖为15，pH为6.9，转染培养基含血清时，壳聚糖-DNA微粒的转染效率最好。有很多研究者对壳聚糖进展改性来进步其转染效率8-9。本实验结果显示，壳聚糖和阳性对照脂质体比拟，转染率低。其原因考虑为壳聚糖-pDNA纳米粒的转染效率受到壳聚糖分子量、粒径、N/P比值、pH值、脱乙酰度、DNA浓度等多种因素的影响。在K8实验中，壳聚糖组及壳聚糖-pDNA纳米粒组显示出较强的细胞毒性，与脂质体组比拟有明显差异(P0.05)。有学者认为，壳聚糖的细胞毒性与脱乙酰度、

16、化学构造、黏度和相对分子质量有关，同一种壳聚糖对不同的肿瘤细胞有不同程度的抑制作用10。本实验中，观察到pH值为一个非常重要的影响因素。壳聚糖为弱碱性，不溶于中性和碱性溶液11。培养基中添加HEPES缓冲盐，是以NaH3和稀Hl调定，pH值为7.07.2，其缓冲才能较强。壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液偏酸，两者混合后，壳聚糖纳米粒在pH值变化后的液体中析出成实验中所见云絮状物，液体浸透压也发生相应变化。细胞对pH值、浸透压变化很敏感，因此镜下观察到脱壁死亡。正因如此，细胞状态差也同时影响了基因的转染率。综上所述，壳聚糖可有效包封DNA,保护DNA免受降解，可以成功地转染至靶细胞内，其转染条件实验

17、的优化及体外转染效果有待进一步研究。【参考文献】1HerEijerH,lffJA.Genetherapyprgressandprspets:hydrdynaigenedeliveryJ.GeneTher,2022，14(2):99-107.2杨晓容,宗莉，袁喜英.壳聚糖纳米粒作为基因载体的研究:粒径对转染效率的影响J.药学学报,2022,42(7):774-779.3LuYL,PengYS,henBH,etal.Ply(ethyleneiine)-g-hitsanusingEX-810asaspaerfrnnviralgenedeliveryvetrsJ.JBiedaterResA，2022，

18、88(4):1058-1068.4aLaughlinF,uperRJ,angJ,etal.hitsananddeplyerizedhitsanligersasndensingarriersfrinvivplasiddeliveryJ.JntrlRelease,1998,56(1-3):259-272.5JiangHL,KiYK,ArteR,etal.hitsan-graft-plyethyleniineasagenearrierJ.JntrlRelease,2022,117(2):273-280.6苏丹，季爱民.壳聚糖纳米基因载体的制备和鉴定J.南方医科大学学报，2022，27(5):595-598.7SatT,IshiiT,kaha