流式细胞术原理及应用(新)课件

1、流式细胞术的原理(yunl)及其应用 马洪星第一页，共八十一页。第二页，共八十一页。FLOW CYTOMETRY 流式细胞术FLOW CYTOMETOR 流式细胞仪第三页，共八十一页。Flow Cytometry Measuring properties of cells in flowFlow SortingSorting (separating) cells based on properties measured in flowAlso called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)第四页，共八十一页。分为三大类： 第一类台式机 光路调

2、节系统(xtng)固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合 用于临床 第二类大型机 科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活 第三类新型流式细胞仪 装配有24根激光管，同时检测15个参数，高速分选达50000个/s第五页，共八十一页。第六页，共八十一页。第七页，共八十一页。第八页，共八十一页。第九页，共八十一页。流式细胞仪的主要(zhyo)组成部分：光路系统(xtng)鞘液系统(xtng)信号转换及放大系统数据处理系统第十页，共八十一页。 流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 目前，该技术以广泛用于生物及医学基础研究与

3、临床检测，在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域(ln y)内发挥着重要作用。第十一页，共八十一页。流式细胞仪荧光显微镜控制电脑人脑光源激光紫外光标本制备成的单细胞（或颗粒）悬液放于固定的标本台上效率高 几百几万个细胞/秒低 几十个细胞/分结果精确、客观有主观因素功能可同时测多个参数、能进行分选一般只测一个参数、不能分选第十二页，共八十一页。鞘液系统(xtng)流动(lidng)室第十三页，共八十一页。第十四页，共八十一页。光路系统(xtng)检测(jin c)区第十五页，共八十一页。第十六页，共八十一页。第十七页，共八十一页。第十八页，共八十一页。第十九页，共八十一页。第二十页，

4、共八十一页。光学(gungxu)原理laser第二十一页，共八十一页。第二十二页，共八十一页。第二十三页，共八十一页。第二十四页，共八十一页。抗体(kngt)标记的方法第二十五页，共八十一页。抗体(kngt)的选择首选直接标记抗体荧光分子 PE最强，适用(shyng)于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记 适用范围广, biotin-avidin不适合 弱抗原的检测第二十六页，共八十一页。数据处理系统第二十七页，共八十一页。流式细胞分析(fnx)的信息Forward scatter(FSC)Side scatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-

5、APC第二十八页，共八十一页。流式细胞的基本信息(xnx): “形态”第二十九页，共八十一页。流式细胞的主要(zhyo)信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原(kngyun)结合第三十页，共八十一页。Gating常用(chn yn)术语第三十一页，共八十一页。流式常见(chn jin)图形 (Histogram Plot)直方图适用(shyng)于：单参数分析第三十二页，共八十一页。流式常见(chn jin)图形 (Dot Plot)散点图适用(shyng)于：多参数分析第三十三页，共八十一页。流式应用(yngyng)常见范围细胞

6、大小细胞的颗粒度细胞表面分子(fnz)：CD 系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等）第三十四页，共八十一页。实验(shyn)对照的设计空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性(yngxng)对照 （用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时第三十五页，共八十一页。实验标本(biobn)的处理单细胞悬液的制备： 物理法（剪碎法、 网搓法、研磨粉） 化学法（酶消化）抗体或标记分子的染色：抗原(kngyun)抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭血清和同型抗体第三十六页，共八

7、十一页。可用流式细胞仪分析(fnx)的标本 外周血、骨髓( su)、癌组织、癌旁组织、石蜡切片、各种体液（尿、脑脊液、胸腹水等） 必需(bx)制备成单细胞悬液单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞粒子、可溶性分子第三十七页，共八十一页。 待测标本 处理成单event悬液 荧光素标记的单抗染色(rns) 鞘液 经处理的细胞单个通过激光聚焦区 检测散射光、荧光 信号转化、放大 计算机数据处理 分选第三十八页，共八十一页。SORTING（细胞(xbo)分选）分选速度(sd)分选纯度分选收获率第三十九页，共八十一页。第四十页，共八十一页。流式细胞术的应用(yngyng) 细胞死亡分两种：凋亡和坏死

8、 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶(sh y)或花的自然凋落一样，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。（一）凋亡(dio wn)的检测第四十一页，共八十一页。细胞凋亡与坏死的区别虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似(xin s)，但它们的过程与表现却有很大差别。坏死（necrosis）：坏死是细胞受

9、到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。第四十二页，共八十一页。细胞(xbo)凋亡的生物学意义 胚胎形成、肌体(jt)正常发育、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。生物医学的研究(ynji)热点第四十三页，共八十一页。凋亡(dio wn)检测每一步都有检测试剂盒每一步(y b)都有检测试剂盒第四十四页，共八十一页。1、半胱

10、氨酸蛋白酶3检测法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、细胞凋亡相关基因(jyn)的流式细胞术检测流式细胞(xbo)术检测细胞(xbo)凋亡第四十五页，共八十一页。 亚二倍体峰（凋亡峰） - PI staining不能区分(qfn)凋亡与死亡细胞第四十六页，共八十一页。Annexin V Assay建议(jiny)用于悬浮细胞第四十七页，共八十一页。Annexin V Assay能够(nnggu)区分死亡与凋亡第四十八页，共八十一页。第四十九页，共八十一页。细胞周期G1MG2SQui

11、escent cellsG0第五十页，共八十一页。（二）定量流式细胞术 （quantitative flow cytomety) 通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反映(fnyng)在某种生理病理条件下出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义。第五十一页，共八十一页。微球流式芯片(xn pin)技术CBA(Cytometric Bead Array)采用夹心法分析策略,以微珠来捕获(bhu)可溶性分子。第五十二页，共八十一页。（三）流式细胞术的临床(ln chun)应用白血病免疫分型HLA-B27: 强直性脊柱炎淋巴

12、细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（CD55、CD59）血小板活化(huhu)试验第五十三页，共八十一页。流式细胞术与造血(zo xu)干细胞移植第五十四页，共八十一页。流式细胞术与白血病免疫(miny)分型第五十五页，共八十一页。流式细胞的免疫(miny)分型：是白血病分型的重要指标，而白血病分类(fn li)是选择化疗方案和判断预后的重要依据。 FAB标准(MICM)，形态学、免疫表型染色体、分子生物学结合,适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。Minimal residual diseases (MRD)第五十六页，共八十一页。微小残留病变的检出（

13、MRD）： MRD是白血病复发的主要(zhyo)根源，FCM的高特异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，早期探测MRD，以免复发。 第五十七页，共八十一页。 有证据表明外周血淋巴细胞HLA-B27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大相关性，利用流式细胞术进行HLA-B27检测，可同时排除(pich)交叉反应，是目前检测HLA-B27的最好方法。流式细胞术与强直性脊柱炎第五十八页，共八十一页。第五十九页，共八十一页。淋巴细胞亚群分析 机体免疫状态(zhungti)是衡量机体是否罹患疾病的重要指标，目前多采用流式细胞术来检测机体的免疫状态(zhungti)，其中最重要的指标是

14、检测T,B,NK淋巴细胞的水平。第六十页，共八十一页。常用细胞表型及意义（cluster of differentiation,CD)CD3 总T细胞CD4 T辅助/诱导(yudo)细胞亚群CD8 T抑制/细胞毒细胞亚群CD19 B细胞抗原CD16+56 NK细胞CD33 髓细胞前体CD34 多能干细胞第六十一页，共八十一页。 由于T淋巴细胞在人体的免系统中承担着重要功能，因此当感染发生(fshng)时，T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反应感染的状态和程度。例如：CD4分子有HIV识别部位，因CD4细胞是HIV病毒的受体，AIDS患者CD4+T细胞明显减少，该指标是诊断AIDS的重要指标。

15、当病毒感染发生时（如乙型肝炎、EB病毒和巨细胞病毒包涵体病毒），CD8+T细胞增多，对CD8T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。 第六十二页，共八十一页。 利用流式细胞仪可对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、CD25+持续增加提示已开始发生排异，CD4+/CD8+ T持续下降(xijing)，表明有感染发生，当其比值小于0.2时必需停用免疫抑制剂。 流式细胞术与移植(yzh)第六十三页，共八十一页。其它免疫性疾病分析 SLE患者的淋巴细胞变化可以反应该病的活动(hu dng)情况和器官侵犯程度，活动(hu dng)或非活动(hu dng)性伴有多系统疾病，但无肾

16、脏损害的患者可出现CD4+ CD8+T比值升高， 伴有严重肾脏损害的SLE患者可出现低CD4+、高CD8+的现象。 第六十四页，共八十一页。流式细胞术与PNH 利用流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH），根据血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所连接的蛋白，如DAF（CD55）与MIRI（CD59），来确诊此病，比传统的血清(xuqng)溶血试验具有更高的特异性与敏感性。 第六十五页，共八十一页。第六十六页，共八十一页。第六十七页，共八十一页。 血小板： 巨血小板 血小板无力(wl)症 网织血小板流式细胞术与血小板第六十八页，共八十一页。血栓性疾与血栓前状态： 由于(yuy)活

17、化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度的增高与疾病的发生发展有关。第六十九页，共八十一页。流式细胞术与网织红细胞第七十页，共八十一页。 DNA非整倍体的出现可能是恶变细胞的重要标志， FCM在肿瘤学上的应用，主要是利用DNA含量(hnling)测定，进行癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作。 癌前病变的癌变率与病变的增生程度一致，而增生程度与DNA含量的异常改变又呈平行关系。 流式细胞术与肿瘤(zhngli)第七十一页，共八十一页。 FCM通过精确定量DNA含量，能对癌前病变的性质和发展趋势作出判断，有助于癌前病变的早期诊断。 DNA倍体分

18、析(fnx)有助于临界性肿瘤的诊断，如卵巢交界性肿瘤，异倍体的出现与病变的恶性发展有关。 第七十二页，共八十一页。 DNA异倍体、高S期细胞比值和高增殖细胞核抗原（PCNA）表达与细胞增殖能力、恶性程度(chngd)和不良预后呈正相关。 第七十三页，共八十一页。 为治疗方案和药理学研究提供依据：不同类型的肿瘤对化疗药物的敏感性不同。可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。 MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp）亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞(xbo)排除荧光染料与细胞(xbo)内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对化疗药物开始出现耐药性，需要考虑其他治疗方式。 第七十四页，共八十一页。流式细胞术与生殖(shngzh)医学 正常男性(nnxng)精液中均为单倍体细胞，而由于精子发生障碍所致不育的男性(nnxng)精液中会出现大量2倍体和4倍体细胞。1