中科大高级生化与分子生物学实验生化部分

1、GI Purification and Characterization实验须知每次签到：上午 和 下午 分别签。参与实验全程，主要实验过程不能轮班。若有课程冲突等其他原因，不能参与实验，要提前请假， 否则按缺课记录。若有较多时间不能参与实验，该小组应考虑重新安排实验时间。两人一组，不要自行合并小组。实验记录试剂配方实验设计，流程操作重点，注意事项所遇到的问题，实验结果忠实记录实验准备及实验过程中的：便于寻找问题，改进方法，撰写论文试剂瓶标签标签内容： 试剂名称 浓度 pH值 配制日期 配制人姓名准备工作 (2人/组)LB培养基0.2甘油: 500ml，pH7.5 灭菌破碎缓冲液： 20ml

2、4C 贮存 STE缓冲液： 50ml 4C 贮存 TEA （pH8.0） 缓冲液: 10ml半胱氨酸盐酸盐: （Cys-HCl) 10mlTCA: 15ml 木糖0.2M（Xylose） 10ml 咔唑 10ml70% 硫酸 250ml 4C 贮存 1000ml 培养瓶用三层锡箔纸封口， 实验流程性质鉴定项目：酶活鉴定（I、II、III步样品）以下性质鉴定用初纯化的酶（II）酶的热稳定性：at 80C 最适反应温度最适反应pH酶动力学参数果糖显色标准曲线蛋白含量测定（ I、II、III步样品）SDS PAGE鉴定纯化效果并测算 分子量（ I、II、III步样品）纯化流程 I 细胞破碎：粗酶 I

3、I 70C 15min：初纯III 脱盐 DEAE sepharose FF 柱纯化注意： 每步纯化要记录总体积 留样品用于蛋白含量及SDS 电泳 （100ul于EP管中，标记后4C 保存 纯化过程中需要收集的数据纯化步骤总蛋白（mg）总酶活(以OD数表示比活 （OD数/mg）纯化倍数得率（）粗酶热沉淀 初纯酶DEAEFF 纯化注意： 1. 每步纯化要记录总体积 2. 留样品用于蛋白含量及SDS 电泳 （取100ul于EP管中，标记后20C 保存 ）菌液的培养条件质粒：PTKDGI （野生型） KanaR受体菌：K38 AmpRK38（PTKDGI）的培养需要Kana (100ug/ml)和A

4、mp (100ug/ml) 两种抗生素接种量：0.3/1000（V/V)30C Overnight42C 热诱导后，37C继续培养2-3hrs， 收菌 洗菌 破碎收菌、洗菌将全部培养液分两次离心后，全部集中于1个离心管中，用STE充分悬浮（震荡或枪吹打）。再离心后悬浮于15ml破碎缓冲液（冷）用于破碎。准备好要破碎的同学请带样品到339 房间用french press 破碎细胞。带一个250ml的烧杯，用于冰浴破碎后的样品。细胞的超声波破碎超声：高频，震动，能量 功 率：功率大，破碎效果好，产热高，蛋白变性多 一般原则：间歇超声，超声数秒钟，停数秒钟，循环多次 超声的必要条件：冰水浴，保证最佳

5、的冷却状态。 冰水浴液面略高于样品液面超声探头的位置： 位于样品液面下1cm我们的超声条件：功率180W, 超声 2 秒， 间歇 2 秒 循环次数：500700次 (视样品多少调整） 纯超声时间：10001400秒 （17min)不正确的超声：探头接近液面，引起液面剧烈波动，产生大 量泡沫蛋白变性 探头接近样品底部，超声效果差超声破碎装置示意图冰水浴菌液超声探头压力破碎仪破碎条件：不同的细胞要求压力不同， 操作仪器要求专门培训，优点： 1. 破碎需要的时间短，过程仅数分钟（与样品量相关）。 2. 破碎的效果优于超声，特别对细胞壁较厚的如酵母等效果明显。 3. 样品变性情况少于超声法。注意：同样

6、有产热现象，需要样品冰浴破碎原理： 破碎Cell内部高压将细胞从很细小的孔中挤出，细胞从压力很高的环境（最高可达4万psi）突然释放到大气压环境，内外巨大的压差使得细胞破碎。压力池内部示意图压力池常用的糖的显色反应：1. 莫氏（Molish）试验糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糖醛衍生物，能与酚类反应生成紫红色缩合物。2. 塞氏（Seliwanoff）试验酮糖在浓酸作用下，生成5羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色。咔唑法咔唑与醛糖酸反应显示红紫色半胱氨酸HCl 、 乙醇咔唑法测酮糖，显红紫色。酶活测定中注意事项正确设置参照反应管：用失活的酶。 （先加反应终止 液，再加酶液。）准确计时，并量取各种

7、试剂： 在进行一组反应时，先设计各试剂加量及加入时间，并用表格列出。严格按设计操作，减少人为误差。分光光度计测量反应液的OD560 ： 一次读数后，应将反应液倒回试管中，以备复查。 数据分析无误后才能丢弃。光吸收OD560读数应在分光光度计测量的有效范围内（即：读数与浓度呈线形关系） 0.3 OD560 1.5本实验酶活测定具体注意事项安全：硫酸. 枪头、试管等严禁乱甩，乱放。防止烧伤安全：爱护分光光度计，及时擦洗仪器内的任何贱出和 外溢， 3. 安全：随时清理实验台面上的溢出及废纸。4. 比色皿处理：反应液有限，不能润洗，测量时选择样品浓度由低到高进行。 每个样品之间将比色皿倒扣在吸水纸上，

8、轻磕即可。5. 反应废液的处理：所有反应废液不得倒入水池，要回收到指定的回收桶中。统一处理。6. 显色反应：加入硫酸后，要充分混匀（震动），然后在冷水或冰水中充分冷却后，才开始进行显色反应（25 C )酶活相对单位以OD560表示要换算成“绝对”产物量的单位，则要做标准曲线， 如以不同浓度木酮糖进行显色反应制作标准曲线， 再计算各酶反应的产物量。粗酶的制备破碎细胞（15ml），离心，收集上清， 记录总体积， 留300ul 粗酶样品于EP管。其余粗酶于70C 加热 15min，离心（5000rpm 12min） 收集上清，记录总体积。测粗酶和初纯酶的酶活， 注意测酶活的反应体系体积全部减半。反应

9、条件不变。反应用短的试管做，试剂直接加到底部，酶反应混匀要轻缓， 显色反应加硫酸后要充分混匀（可震荡），冷却后再加咔唑和CysHCl不要忘了空白对照管！对照管各组分与其它反应管所含组分应相同！酶学性质鉴定时的酶液用量需要根据各组所制粗酶的酶活，考虑温度、pH等因素的影响，进行适当调整。使一组反应的OD560读数大约介于1.01.5之间 若因酶液用量大而影响反应体积，则需要考虑换用 4X 或 8X 的反应缓冲液，GI 酶反应最适温度测定温度：55，60，65，70，75，80，85，90 C 共八个温度点。缓冲体系：反应液中Mg2终浓度：5mM 磷酸钠缓冲液：50mM提供试剂：1. 400mM磷

10、酸钠缓冲液，pH8.0 2. 40mM MgCl2。取用酶量：依据所测初纯酶的活性，因反应温度较高，每反应估计用原酶量的2/3或3/5体积。 酶的用量以样品的相对酶活（OD值）来衡量酶液0.2M木糖63ul 40mM MgCl232ul400mM磷酸缓冲液32ulH2O 250ul例：如果50ul 初纯酶的酶活是OD1.0，本次反应可用同样的酶量。若OD0.5，则建议适当加大酶量。若OD1.5，应适当减少酶的用量。 显色体系减半GI热稳定性测定温育温度：80温育开始取样时间：0m，10m，20m，30m，40m， 50m，60m，80m，100m，120m。缓冲体系：反应液中Mg2终浓度：5m

11、M TrisHCl pH8.0: 20mM提供试剂：1. 1M TrisHCl pH8.0 (室温调） 2. 40mM MgCl2取用酶量：因样品要在80保温，建议取用酶量应使OD值达到1.8。酶液 40mM MgCl2 1M Tris-HClH2O 2500ul 请按2500ul设计总体积(酶反应温度依旧为37 ）每个时间点的取样量为 210ul， 初酶用量依据各组酶活而调整。但每组各时间点的取样量是不变的。降温至37 后每个反应加 65 ul 0.2M 的木糖 显色体系减半GI最适反应pH 测定1.用50mM TEA、10mM MgCl2 buffer, different pH, 共7个

12、点.2. 每个pH反应设一个对照。3.反应体系： 在60 C预热 150ul pH buffer 40ul 0.2M木糖酶(自定）水总体积250ul4. 60 C反应10min 后，加 25ul TCA 终止，5. 显色: 1.5ml +50ul + 50ul酶用量：每个反应有1.5OD。GI酶反应动力学参数测定动力学参数测定反应缓冲体系的最终浓度：5mM MgCl2，25mM TEA （pH7.5）提供1. 40mM MgCl2200mM TEA（pH7.5）buffer， 2. 0.4 M 和0.2M和0.1M木糖（各反应的木糖浓度以250ul终体积核算），在满足第5点的前提下，应尽可能用

13、低浓度的木糖母液，以减少操作误差。各木糖浓度准备一个参照反应管。反应体系：37 C 反应， 反应时间5分钟 (32ul 8x TEA buffer、木糖、水)=95ul 底物-buffer mix 95ul（底物-buffer mix）+ 酶（自定）+水 250ul终止，50ul TCA， 两人合作保证每管反应时间都是同样的时间长度显色： 1.5ml 50ul50ul， 安排每管显色时间有时间差，并在读OD值时以同样的时间差进行，减少系统误差。 将相对酶活（OD值）转换为相对绝对的产物生产量：以250ul不同浓度的果糖代替木酮糖进行显色反应制作标准曲线。提供的果糖母液：0.2 M分别稀释呈终浓

14、度为：20mM，5mM，1mM，0.5mM，0.1mM，0.05mM, 0mM柱层析前要做的准备工作保留300ul样品以备用于蛋白含量测定及SDS电泳。上柱样品的脱盐：a. 透析，b. 过柱。过柱脱盐：多选用Sephadex G-25/G-50. 宜在脱盐后马上上层析柱。配制不含PMSF的低盐洗脱液（500ml）和高盐洗脱液（统一配制100ml/组），过滤全部溶液，于4 C 保存。实验室提供：1M Tris-HCl buffer , pH7.5PMSF 100mMAspects needs to be considered when choosing gel 凝胶类别选择：阴/阳, 强/中/弱

15、, 离子型， 不溶性母体粒度与形状：粗、中、细， 流速与分离效率交联度： 高交联度分离小分子 低交联度大分子交换容量：可结合样品的位点数 稳定性：适用的pH值范围胶粒的耐压范围： 柱长， 流速，正确选择离子交换剂盐离子竞争洗脱pH梯度改变样品电荷洗脱装柱及平衡胶：DEAE Sepharose Fast Flow 弱阴离子交换剂。 能够吸附带负电的离子，超声脱气柱床体积： 25ml柱床要求无气泡，无断层。用0.1M NaCl 100ml (抽滤过）洗柱，流速2ml/min用抽滤过的起始缓冲液平衡柱至： 电导=起始缓冲液电导夹住柱下端，吸去柱上多余液体，准备上样 样品脱盐装一个10ml的G-25/

16、50小柱，用抽滤过的低盐缓冲液洗5个床体积后，将离心后的酶液上小柱脱盐，收集流出液：取150ul于EP管中保存（20度）其余的用于离子交换柱层析。上样：将样品加到柱上，控制流速（0.30.5ml/min），开始监测流出液，并用一干净烧杯收集。待所以样品完全进入胶后，往柱内加入低盐buffer(+PMSF)约1cm柱高后，开始低盐buffer(+PMSF)洗脱直至洗脱曲线走平。改用梯度洗脱，并收集目标峰。梯度洗脱：0.1mol/L0.5mol/L NaCl 梯度洗脱即低盐buffer ：100ml 高盐buffer ：100ml 流速： 1 ml/min 开始分布收集收集收集的样品峰用超滤设备超滤浓缩后测酶活，测蛋白含量，SDSpage鉴定。1. SDS(12.5%)Total volume : 8ml AP & TEMED *26X loading bufferThree