2016届血液科血液

1、miR-148a与DNMT1在急性髓系白血病发病中作用的初步研究博士研究生：王晓雪导 师：李 艳 中国医科大学附属第一医院 血液科主要汇报内容研究背景，立题依据1研究目标及主要研究内容2技术路线3实验结果4研究的创新点及总结5急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)骨髓原始细胞异常增殖、髓系前体细胞分化受阻2 受癌基因/抑癌基因表达的调控3造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病1研究背景临床特征形态学免疫表型核型遗传学分子生物学AML的异质性成人最常见的急性白血病1年发病率：3-4例/10万人预后较差5年OS：50%老年患者2年OS：20%异质性明显21. C

2、agnetta A, et al. Leuk Res. 2014 Jun;38(6):649-59. 2. Naoe T, et al.Int J Hematol. 2013 Feb;97(2):165-74.研究背景急性髓系白血病 Company Logo研究背景The secondary structure of pre-miR-148(from Gene database，by D.Stewart and M.zuker,2007 Washington University)Pre-miRNA-148a定位于基因组7p15.2，属于基因间miRNA （chr7：25,956,064-25

3、,956,131）长度为68nt.成熟miR-148a序列为44| 5-UCAGUGCACUACAGAACUUUGU-3 |65。研究背景AuthorTissues/cellsexpressionBiological functionLiffers STadenocarcinomas vs.normal pancreatic ductal cellsDown-regulatedTumor growthChen YGastric/colorectal cancer vs. Tissue adjacent to carcinomaDown-regulatedAssociated with tumo

4、r size and disease stageZhou Xinovarian cancer vs. Normal ovarian epithelial tissueDown-regulatedcell proliferation Yu JBreast cancer cell lines vs. Normal breast cell linesDown-regulatedTumor angiogenesisLombardUrothelial cell carcinoma of the bladder vs. normal bladder epithelial cellsDown-regulat

5、edincrease apoptosis Fujitahormone-refractory prostate cancer cells vs. normal human prostate epithelial cells Down-regulatedincreased the sensitivity to anti-cancer drug MagrelliHepatocellular carcinoma vs. normal liver cellsDown-regulatedcell proliferation Kim Jhuman glioblastoma specimens vs. nor

6、mal human brain and astrocytesUp-regulatedIncreased cell growth and survivalGokhale AWNT signaling associated medulloblastomasUp-regulated-miR-148a在多种肿瘤性疾病中的差异表达 DNA 甲基化是通过 DNA 甲基转移酶的催化作用，将活性甲基从 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移至 C5 胞嘧啶上，生成 5-甲基胞嘧啶（5-mC） CpG 岛以富含 CG 碱基为其特征而有别于其他基因DNA甲基化转移酶家族（DNMTs），是DNA甲基化作用中最重要的酶类，其

7、主要包括DNMT1，DNMT2, DNMT3A，DNMT3B，DNMT3L 研究背景DNA 基因启动子区 CpG岛高甲基化是许多抑癌基因表达沉默的关键因素 大量抑癌基因因其启动子区域甲基化而低表达或沉默，都可能与DNMT1高表达相关inhibition研究背景miR-148a基因启动子区高甲基化可能是其表达下调的原因 DICmiR-148a CpG island hypermethylation 生物信息学预测DNMT1可能为miR-148a的靶基因根据 预测结果 根据 预测结果可能存在miR-148a与DNMT1的循环调控DNMT1与DNMT1 3UTR靶向结合miR-148a在许多肿瘤性疾

8、病中存在差异表达，影响肿瘤细胞的多种生物学行为；在AML中，多种miRNA发挥癌基因/抑癌基因的作用，针对miR-148a在AML中生物学功能及调控机制仍不明确DNA甲基化在血液恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用；DNMT1是甲基化最重要的酶类之一，在多种肿瘤性疾病中高表达，大量具有抑癌性质的基因甲基化都可能与DNMT1高表达相关生物信息学分析提示DNMT1是miR-148a的靶基因。相关研究显示，miR-148a-DNMT1之间可能存在循环调控的关系立题依据研究目标研究miR-148a在急性髓系白血病中的表达水平探讨在急性髓系白血病细胞系中miR-148a低表达的可能调控机制以及其与DNM

9、T1的相互作用关系研究miR-148a在急性髓系白血病细胞系中的生物学功能收集AML患者和正常对照的骨髓标本，采用RT-PCR 的方法检测miR-148a和DNMT1的表达在AML细胞系中通过转染的方法过表达或抑制miR-148a，分析其对该细胞增殖、细胞周期，细胞凋亡的影响表达差异机制研究生物学效应分析miR-148a表达下调是否由于其启动子区发生高度甲基化，并且甲基化的发生是否与DNMT1相关；miR-148a是否能够直接靶向调控DNMT1研究内容临床骨髓标本收集（AML患者80例，正常对照20例）Real-time PCR检测miR-148a的表达分析表达差异与临床资料间的关系裂解液法提

10、取骨髓有核细胞Trizol法提取总RNA，测定浓度及纯度PolyA加尾，提取microRNA反转录，microRNA cDNA合成分析表达差异反转录合成cDNAReal-time PCR检测DNMT1表达技术路线（1）培养AML细胞系U937、 THP-1、 Kasumi-1应用甲基化特异性PCR（MSP）检测miR-148a启动子区甲基化水平MSP检测甲基化水平变化在U937细胞系中应用shRNA干扰DNMT1基因Real-time PCR检测miR-148a表达变化提取基因组DNA技术路线（2）Western Blotting检测DNMT1蛋白表达RT-PCR检测miR-148a及DNMT

11、1 mRNA表达设计合成miR-148a 模拟物mimics及抑制剂inhibitor，分别转染AML细胞系U937及Kasumi-1应用Real-time PCR检测转染效率应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a与靶基因DNMT1结合情况应用流式细胞术检测细胞周期应用CCK8法检测细胞增殖应用Real-time PCR及 Western Blotting检测转染后DNMT1表达变化Annexin V-FITC/PI检测凋亡技术路线（3）应用Real-time PCR检测miR-148a表达水平，结果显示在AML患者中miR-148a表达水平较正常对照组显著降低miR-148a在急性髓

12、系白血病中的表达情况与临床基本资料的关系 以miR-148a中位表达水平作为分界，将患者分为miR-148a高表达组和miR-148a低表达组，比较两组患者的基本资料。结果提示在性别，年龄，白细胞,血红蛋白,骨髓原始细胞比例等方面2组比较均未见明显差异，但miR-148a高表达组患者血小板数值较低表达组显著升高FAB分型与miR-148a的表达染色体核型/基因突变类型与miR-148a的表达AML患者疗效比较与miR-148a的表达miR-148a在AML细胞系中的表达情况应用Real-time PCR检测miR-148a表达水平，结果显示在AML细胞系中miR-148a表达水平较正常对照组显

13、著降低MSP检测miR-148a启动子区的甲基化水平 U M U M U M U M U M U M PC 正常 U937 THP-1 Kasumi-1 NCAML患者和正常对照组DNMT1的表达应用Real-time PCR检测DNMT1表达水平，结果显示在AML患者中DNMT1表达水平较正常对照组显著升高miR-148a与DNMT1表达的相关性分析相关性分析结果显示，DNMT1 mRNA的表达水平与miR-148a的表达呈显著负相关,相关系数r=-0.852，P0.05急性髓系白血病细胞系DNMT1的表达178kd43kdDNMT1-actin 正常 U937 THP-1 Kasumi-1

14、mRNAShRNA干预DNMT1的表达合成3种DNMT1-shRNA干扰DNMT1的表达，选择DNMT1表达相对较高的U937细胞进行细胞转染，通过RT-PCR检测转染后DNMT1 mRNA 的表达，筛选出有效的抑制序列（shRNA-3）抑制DNMT1表达后miR-148a启动子区甲基化水平变化DNMT1表达受抑制后，MSP检测miR-148a 基因启动子区甲基化水平降低抑制DNMT1的表达后，RT-PCR检测miR-148a表达水平明显升高抑制DNMT1表达后miR-148a表达水平变化生物信息学预测DNMT1可能为miR-148a的靶基因根据 预测结果 根据 预测结果应用miR-148a

15、mimics/inhibitor转染U937/Kasumi-1后转染效率验证U937miR-148aKasumi-1miR-148ablank1.020.04blank1.030.03NC1.000.03NC1.000.04miR-148a mimics112.853.27miR-148a inhibitor0.280.02应用miR-148a mimics/inhibitor转染U937/Kasumi-1后DNMT1表达水平178kd43kdDNMT1-actin U937 NC-1 mimics Kasumi-1 NC-2 inhibitor双荧光素酶报告基因载体构建miR-148a ta

16、rgetIn absence of miR-148a activityIn presence of miR-148a activity.引自载体说明书pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector E1330双荧光素酶报告基因检测miR-148a 与DNMT1-3UTR的结合情况DNMT1 3-UTR 野生型载体和miR-148a mimics共转染组较阴性对照及空白对照组比较，荧光素酶活性明显降低。DNMT1 3-UTR 突变型载体和miR-148a mimics 共转染组与阴性对照及空白对照组比较， 荧光素酶的活性差异无显著性A

17、ML中miR-148a与DNMT1存在循环调控关系DNMT1与DNMT1 3UTR靶向结合CCK8检测U937细胞转染miR-148a mimics后各组细胞的增殖情况CCK8检测Kasumi-1细胞转染miR-148a inhibitor后各组细胞的增殖情况AV/PI流式检测U937细胞转染miR-148a mimics后各组细胞的凋亡水平controlNCmiR-148a mimicsAV/PI流式检测Kasumi-1细胞转染miR-148a inhibitor后各组细胞的凋亡controlNCmiR-148a inhibitor流式检测U937细胞转染miR-148a mimics后各组

18、细胞的细胞周期controlNCmiR-148a mimicscontrolNCmiR-148a inhibitor流式检测Kasumi-1细胞转染miR-148a inhibitor后各组细胞的细胞周期在急性髓系白血病中，miR-148a存在异常低表达，并与多种临床特征相关在AML细胞系中，miR-148a的低表达与其启动子区的高甲基化水平相关，DNMT1的高表达导致miR-148a基因启动子区高度甲基化，进而导致miR-148a的沉默DNMT1是miR-148a下游直接靶点，受其负向调控，在AML细胞系中，miR-148a的低表达导致其对DNMT1抑制作用的减弱，进而导致DNMT1表达水平的进一步升高以及miR-148a的进一步沉默miR-148a与DNMT1在AML中存在循环调控的关系miR-148a过表达抑制AML细胞系增殖，促进凋亡，发挥抑癌基因的作用总结在急性髓系白血病中，针对miR-148a的表达水平进行了研究并且首次对miR-148a在AML细胞系中的生物学功能进行初步探讨在急性髓系白血病细胞系中，首次探讨了miR-148a的下调机制是由于启动子区的高度甲基化，并且甲基化的水平受DNMT1的调控； miR-148a靶向作用于DNMT1。 miR-148a与DNMT1在急性髓系白血病中存在循环调控的关系 创新性的自我评价在学期间