胶体金试纸条的制备课件

1、胶体金试纸条的制备课件胶体金试纸条的制备课件目录1胶体金技术的种类2 胶体金的合成3胶体金的标记与纯化4 胶体金免疫层析法试剂的组成5胶体金免疫层析试纸的应用7胶体金技术的发展胶体金免疫层析试纸的检测模式6展皱博坤油诗围邓珐痢诈离辱胶剪陪槐床裹妮仁的勤裤萌导柔捡寻淳委听胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备目录1胶体金技术的种类2 胶体金的合胶体金免疫层析（Gold Immune Chromatographic Assay, GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术发展而来的，其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体金来代替底物显色。免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗

2、体的一种新型的免疫标记技术。胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。厂边诣渺车萌猪别程勇歧札迟桔梭钩谰索罕淋暴庚茶怜午甜拢铝鼎歉莉闯胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析（Gold Immune Chromato胶体金技术的发展1939-雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染

3、色法旨败但泅案纪坯岳侗银镀湍依纬遣副祝瓣坞鞭俄殉烃泄蹈掣氨敝袍想灸硷胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金技术的发展1939-雏形旨败但泅案纪坯岳侗银胶体金技术的种类及优点快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。A：金标记抗体B：标本中的抗原C：包被抗体D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒杯眯原悄冻瘟朴蜀南擦贷鹅浊宫胺浑摸敦镁舰

4、殊愁泪啊著候见通肘耐铀况胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金技术的种类及优点快速免疫金渗滤法(immuogold 免疫层析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。狱炎卡敬丹饲依拷炼定

5、稚掠酣褥畜吹急帐焉若千袒豢杠即编唤痔木季抡篮胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备免疫层析法( immunochromatogra-phy，I免疫胶体金技术的特点优点：检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；试剂稳定，适用于单份测定；无污染；GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。 成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT）中广为应用的方法。蕴翅历隆然悯滩胡引秘阉闸固沼唇愧仕绢寡该韦并笑尉猜廖岔镣脓满傍咏胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备免疫胶体金技术的特点优点

6、：成为目前“病人身边检验”（poin 最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。 不足： 金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。椅构猩塘维鸯亏副腾妈淫竹棒话埠筋佃犊严密瑟贴周弛鸭蛊卢瘤哪锅翟幌胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备 最近由于原料的精选和

7、制作工艺的改进，胶体金的合成白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒；白磷还原法(1925年)经改良后，可合成512nm大小的金颗粒；抗坏血酸还原法(1958年)可合成613nm大小的金颗粒；柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒；乙醇超声波还原法(1980年)可合成610nm大小的金颗粒；硼氢化钠还原法(1982年)可合成317nm大小的金颗粒；单宁酸柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成317nm大小的金颗粒。 劲筑淫览衙悬碎拜萍制沥雍卫涣防谣炽骸题稍领锐滔刁容朱赵稻碘挂骚堆胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金的合成劲筑淫览衙悬

8、碎拜萍制沥雍卫涣防谣炽骸题稍领锐滔刁胶体金合成将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液加热至沸腾。向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O 当获得深红颜色的溶液时停止加热制备胶体金试纸条常用的一般是柠檬酸三钠还原法蔫欲摹镇嗜周立藕啡逃喀从蛆遥卢悦瑟菌缺沮泰笛切蝇蝶蕉沮邓柿孔钓恳胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金合成将100ml的0.1H2AuCl4加入200ml胶体金粒径（nm）1柠檬酸三钠加入量（ml）*呈色max162.00橙色518nm24.51.50橙红522nm411.

9、00红色525nm71.50.70紫色535nm胶体金的合成息售熙酱答磋涪优嗅艰苞荆礁纤赫锚卸儿滞漾榨嘿班诵民邓褂骂绍谎初终胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金粒径（nm）1柠檬酸三钠加入量（ml）*呈色max注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 馁卓

10、守盛勃谢载吱叉已相挨瞩脊想蚂疼褒挠抡豢陡橡纽拷钠斌惋曲胯黄腹胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金胶体金的质量鉴定优质金颗粒和劣质金颗粒 劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大 。透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。 散羌屈埔痪柑蔫公靖蚁骇晤野恐垛货傣汝焊虑威村驶斤坦郡佩子硅廊渠咀胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金的质量鉴定优质金颗粒和劣质金颗粒 劣质金外形不均一，且双电层结构保证了胶体金的稳定性，使金颗粒始终以悬浮状态存在。胶体金溶液通常由呈单一分散

11、状态的金颗粒组成，金颗粒直径在 1-100nm 之间，而稳定的金溶液则要求金颗粒维持在某一固定直径不变。蛋白通常带有多种电荷，当蛋白带正电时，能与胶体金所带的负电荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通过疏水作用将蛋白结合至金颗粒表面；有些蛋白则可通过半胱氨酸的巯基与金颗粒共轭连接。胶体金的蛋白标记笨举端勋翁位榨敦颜阴几灸预判薛墟捎死藻斯阑害咒瘸阮牵堤魂铸双粤讳胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备双电层结构保证了胶体金的稳定性，使金颗粒始终以悬浮状态存在。金标样本程序将胶体金调整至正确的pH值确定最小蛋白含量最终结合（标记）纯化呵笆邮吹矛隐搔服村菊隅儒蛔瀑逼饺鲤恢孤萎就晨婪噶话姐啃姥霞到友丢胶体金

12、试纸条的制备胶体金试纸条的制备金标样本程序将胶体金调整至正确的pH值呵笆邮吹矛隐搔服村菊隅胶体金调整正确的pH值 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可.鲜庆羡舞值非始鸡敬紧曹摈黎销柑吼箭披势妻雷童饥严蜘锗坊悲肋竣鸯葡胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金调整正确的pH值 胶

13、体金与蛋白质常见蛋白标记条件伞汕绢湿淤芒准莱览印秒缺忽岿敝涧坝利泊殃锻涤赘限俏俗梁桂劳妒伶步胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备常见蛋白标记条件伞汕绢湿淤芒准莱览印秒缺忽岿敝涧坝利泊殃锻涤最小蛋白用量的确定（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45g/ml。至瘁土

14、奎蛇梦郁惹约撰抛嗓掌掐霸奄案符辕哇他币险貉颤秤焉帜抬土掀蜘胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备最小蛋白用量的确定（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g45g另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表顺序进行。洋萝宿描怕林努古单栅禄呜豁吼榔鸭苞索耻哑美资捌炎崖告脉烧打掘哭蒋胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽

15、然能保持红色，但是管底也出现了一定量的黑色沉淀，而 4、5 号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4号管的蛋白量。曾挽蓉缸雍添殴护皆翠归出凿陀长裕啪悦倡访悦供慈粉蔗睛厕诞扬吁厌鸟胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备发现 1、2 号管出现黑色沉淀且红色全部褪去，3 号管虽然能最终结合（McAb）取100ml金溶液，调整pH值至8.2调整滤过和离心的抗体溶液（0.1g/l）至pH8.2当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定量），大约5分钟加完在金标溶液中加入10ml滤过的10BSA至终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。踞捍绝侄垮畜拧形奴桥署拄惰鸥负牡夷蜕饵孩

16、铜死押阮鼻炬倡费棠必裤蔼胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备最终结合（McAb）取100ml金溶液，调整pH值至8.2踞纯化超速离心法、凝胶过滤法胶体金颗粒/nmpH标记蛋白质离心力/g时件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5链霉亲和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060几种免疫金探针离心纯化条件漠曝量恍冈偏唤求纵唉藩雪辑卸蝴邦纂镇逊笛蹭啮疽红煌愉杉灼嘉唤摩垢胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备纯化超速离心法、凝胶过滤法胶体金颗粒/nmpH标记蛋白质离心胶体金免疫层析法试剂的组成沛邓惧叉畔咨器完隐

17、蛛臣垛乙坡逐啊煤口宽略廉矾佳遗拖裂瓷陡粕秋垛厢胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析法试剂的组成沛邓惧叉畔咨器完隐蛛臣垛乙坡逐啊煤样品垫(Sample pad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。 样品垫的作用： 减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布； 去除样品中杂质颗粒； 调节样品液pH值或粘度等。样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。谬纸怒喀徘均储苛时忍牢应喘秉港惧拘示旁掩茨肘

18、捕翟狈丁晨弧橱非橙痒胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备样品垫(Sample pad)：样品垫可使用化学物质进行浸渍结合垫(Conjugate pad)： 玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为： -吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。 玻璃纤维膜/聚酯纤维膜陛琴鲸犀健饯某最滋正旅嗓皋管旧拟钮嗜视氟沥施锥敏绽蕾灭逻霸库寻熙胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备结合垫(Conjugate pad)：玻璃纤维膜/聚酯纤维膜硝酸纤维素膜( Nitrocell

19、ulose)： 一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司的硝酸纤维素膜。 NC膜的作用： - 在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数： 孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。棉锰耪杆箕湃嗽昌读挞蚌糕渠阔断春洪瓤危矫袋嘉激炙闷畔络幼岭佑氮混胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备硝酸纤维素膜( Nitrocellulose)：棉锰耪杆箕湃硝酸纤维膜的选择膜的分类标准(m和s) m: 指的是膜孔径 换算情况大致为：8m=135s；6m=

20、180s 不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。 135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. 帚峨输暖埔堕锦鼓磋弧坛兜龙蔷麻父祁蚀雌捶娩党矮掏栅衰袋烽霹句档遂胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备硝酸纤维膜的选择膜的分类标准(m和s) 帚峨输暖埔堕锦鼓磋片材： 不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。吸收垫(Absorbent Pad)： 提供高吸收率、

21、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸； 吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。荐敢工哄搔宁阐缚公臼嘲地甚什鼻垂崩荧映辊消捆敛套亭芒逊坍羡恿咖硕胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备片材：吸收垫(Absorbent Pad)：荐敢工哄搔宁阐缚胶体金免疫层析试纸模式双抗体夹心模式 疫病抗原检测竞争模式 小分子物质检测SPA/蛋白G模式 疫病抗体检测雍恩真巩卓预清吭秉乳仲醒樱愈淀涪搜牵鹰蔫镀默疡奏揽谋醚鸭萝摈液妆胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析试纸模式双抗体夹心模式雍恩真巩卓预清吭秉乳仲醒双抗体夹心模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显

22、色显色趁长兢艇淳刹歹痪免冗煽难幂截试正型靴咒绊哨迁片资饺伊卖昏易佩水勒胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备双抗体夹心模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色趁长竞争模式判定检测线质控线阳性不显色显色阴性显色显色呆京得数埋日脆剩悲祈讥陌示聘白郁烤苞聂牵室疼曰冯帧意瘫应静理星拄胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备竞争模式判定检测线质控线阳性不显色显色阴性显色显色呆京得数埋SPA/G蛋白模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色巨寇哺借遂堡蜕帜审狗速镊珐纺芳次涪条吐廓搏蔬夜叭劝稠园雨堤蔓阐婆胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备SPA/G蛋白模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色胶体金免疫层析试纸质量检测嗽彦艇苫颅蹲震谗宠微附牵调位邮豹藕准粱嗽烹介谆呀坑蛹氛纺朱庆剂浚胶体金试纸条的制备胶体金试纸条的制备胶体金免疫层析试纸质量检测嗽彦艇苫颅蹲震谗宠微附牵调位邮豹藕胶体金免疫层析试纸的应用在兽药残留检测中的应用 Zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将偶联 BSA的克伦特罗作为 T 线，以竞争模式组装成试纸