METT11D1抗体的制备与鉴定

1、METT11D1抗体的制备与鉴定赵静 ,丁丽华 ,甘纯玑 ,李杰之 ,叶棋浓【摘要】目的 :制备METT11D1(methyltransferase 11domain containing 1.简称其为GA9)（GenBank: AK024512）的多克隆抗体 ,并对其特异性进行鉴定。方式:融合表达 GSTGA9（1228aa）和 GSTGA9（229456aa）蛋白 ,利用包涵体纯化蛋白方式纯化蛋白,常规免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用转染带有FLAG标签的FLAGGA9真核表达载体的293T 细胞裂解物, Western blot检测抗体的特异性。结果:取得了GSTGA9（1228aa）和G

2、STGA9（229 456aa）融合蛋白 ; 利用这些融合蛋白取得的多克隆抗体可特异识别 FLAG GA9蛋白。结论 : 成功取得可特异识别 GA9的多克隆抗体 , 为进一步研究 GA9的功能奠定了坚实的基础。【关键词】 GA9; 多克隆抗体在雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 的信号通路中 , ER 并非是单独发挥作用的 , 而是要与多种蛋白质发生彼此作用 , 并受到这些蛋白质的阻碍 , 进而引发下游基因表达的转变 , 发挥其生物学功能, 这是一个动态平稳的进程。与 ER结合的蛋白质被统称为 ER共调剂因子 , 当机体中的这些蛋白质发生异样表达时 , 就会通过与 ER

3、 的彼此作用致使下游基因表达的异样 , 从而引发癌症的发生 1。 GA9可能确实是如此一种蛋白,它是以ER 作诱饵通过酵母双杂交从乳腺cDNA文库中钓取的基因 ,编码 456 个氨基酸（ GenBank AK024512）。本实验中构建了GSTGA9（1228aa）和 GSTGA9（229456aa）融合蛋白表达载体 ,从包涵体中纯化了GSTGA9(1228aa) 和 GSTGA9(229 456aa)两种融合蛋白 , 并将其免疫小鼠 , 取得可识别GA9蛋白的特异性抗体 , 为进一步研究 GA9在乳腺癌中的功能提供了条件。材料和方式材料克隆载体 pGEXKG、 DH5、 FLAG GA9均为

4、本实验室保留。 293T 细胞为本实验室保留 , 采纳含 100 mL/L 胎牛血清 ( 江海生物工程 )的 DMEM培育基 (Invitrogen 公司 ) 于 37、 50mL/LCO2培育箱内常规培育。转染试剂 Vigofect 购自威格拉斯公司。抗 FLAG单克隆抗体 (mAb)购自 Sigma 公司 , HRP标记的羊抗鼠 IgG 购自 Vector 公司。限制性内切酶购自 NEB 公司 , 高保真 pfu DNA 聚合酶、 T4 DNA 连接酶购自Promega公司 , 质粒提取试剂盒 ( 包括小量提取和大量制备 2 种) 购自Qiagen 公司 , DNA 胶回收试剂盒及PCR产

5、物回收试剂盒购自Promega公司。方式重组质粒的构建别离以表 1 中所列的引物 ,以 pcDNA3FLAGGA9为模板 ,PCR扩增 GA9(1228aa) 和 GA9(229456aa) 编码序列 ,双酶切 PCR产物 ,将 PCR产物别离插入到一样双酶切的pGEXKG载体中 ,即得重组质粒。 PCR扩增条件为 : 94 变性 1 min 后,按以下参数进行29次循环 : 94变性 1 min, 55复性 1 min, 72延伸 2 min,最后 72延伸 7 min。PCR扩增所用酶为目前保真度最高的pfu DNA聚合酶。表1 扩增 GA9的引物及酶切位点（略）GA9 融合蛋白的表达鉴定

6、将含 pGEX KG空载体、pGST GA9(1228aa)和 pGSTGA9(229 456aa) 的 DH5以 1转接到 5 mL LB 培育基中 , 30 培育到A=时加入 IPTG mmol/L), 30培育 45 h, 收菌 , 进行考马斯亮蓝染色和 Western blot 检测 2。多克隆抗体的制备将含 pGSTGA9(1228aa) 和 pGSTGA9(229456aa) DH5以 1转接到培育瓶中 , 扩大培育 , 30 培育到 A=加入 IPTG mmol/L), 30 培育 45 h, 收菌 , 超声破碎 , 搜集包涵体 , 利用尿素洗去杂蛋白。将纯化后的 GST GA9

7、(1 228aa) 和 GST GA9(229456aa) 包涵体蛋白与福氏完全佐剂 11 混匀后 , 皮下多点注射BALB/c小鼠 , 第一次免疫后每 2 周增强免疫 1 次, 末次免疫后第 7 天眼球取血 , 免疫血清于 -70 保留 2。哺乳动物细胞的转染用 DMEM培育基 ( 含 100 mL/L FBS)将 293T 细胞接种在 6 孔板中。接种后 24 h, 将总量为 5 g DNA与 100 L NaCl 混合 , 再将 2L Vigofect 与 100 L NaCl 混合 , 然后将上述两种溶液混合 , 室温放置 20 min,加入到细胞中 , 4 h后换液。Western

8、blot检测融合蛋白表达鉴按时 ,将诱导表达后的细菌搜集,加入 SDS加样缓冲液 ,煮沸 10 min,离心后取上清液进行SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上 ,用 HRPGST抗体进行 Western blot检测。在硝酸纤维素膜上加入50 g/L 脱脂奶粉稀释的HRPGST抗体 ,室温轻摇 1 h, TBST洗 3 次 ,每次 7 min,化学发光法显色5 min,压片显影。多克隆抗体鉴按时 , 293T 细胞转染 24 h 后,搜集细胞 ,加入 SDS 加样缓冲液 , 煮沸 10 min, 离心后取上清液进行 SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上 , 别离用制备的免疫血清和 FLAG

9、 抗体检测。用 FLAG抗体检测的步骤同上。用免疫血清进行Western blot检测时 ,用 100 g/L 脱脂奶粉 4封锁留宿 , 加入 11 000 稀释的免疫血清 ,室温轻摇 1 h, TBST 洗 3 次, 每次 7 min,加入用 50 g/L脱脂奶粉稀释的 HRP 羊抗鼠 IgG, 室温轻摇 1 h, TBST洗 3 次, 每次 7 min, 化学发光法显色 5 min, 压片显影。结果重组质粒的构建与鉴定别离用表 1 中的限制性内切酶双酶切重组质粒pGSTGA9(1228aa) 和 pGST GA9（229 456aa）及空载体 pGEX KG, 取得了与预期大小相符的外源基

10、因插入片段 ( 图 1), 而对照空载体经双酶切后无此插入片段 , 说明克隆已经成功。重组质粒经序列测定证明 , 编码区序列完全正确（数据略） 。蛋白在大肠杆菌中的表达将 pGEX KG空载体及 pGSTGA9(1 228aa) 和 pGST GA9（229456aa）融合表达载体转化入DH5 中诱导表达 , 经考马斯亮蓝染色鉴定 （图 2A）和用 GST抗体进行 Western blot分析说明（图2B）, GSTGA9（1228aa）和 GSTGA9（229456aa）融合蛋白取得正确表达。GSTGA9融合蛋白的纯化利用包涵体纯化方式纯化后的蛋白经考马斯亮蓝染色鉴定（图 3A）和 West

11、ern blot 分析（图 3B）取得大量的纯度较高的 GST GA9（1 228aa）和 GST GA9（229 456aa）融合蛋白。GA9 在哺乳动物细胞中的表达及多克隆抗体的鉴定为便于 GA9抗体特异性的验证 , 将空载体 pcDNA3 FLAG和 pcDNA3 FLAG GA9重组质粒别离转染 293T 细胞 , 搜集细胞总蛋白质进行 SDS PAGE, 用 FLAG抗体进行 Western blot 分析。结果说明 , pcDNA3 FLAG GA9在真核细胞中表达了相对分子质量 (Mr) 约为 55000 的蛋白质 , 而空载体无蛋白质条带 , 与预期结果相同 ( 图 4A)。用

12、制备的免疫血清进行 Western blot 分析 , 结果说明 , 转染 FLAG GA9 重组质粒的 293T 细胞中都可检测到 Mr 正确的蛋白条带 , 且条带位置与用 FLAG抗体检测的条带位置相同 , 而转染空载体的 293T 细胞中未检测到任何条带 ( 图 4B、 C) 。这些结果说明制备的多克隆抗体能特异地与 GA9蛋白反映。讨论每一年全世界每一百万新病例中,乳腺癌是其中发病率较高的恶性肿瘤 , 占女性肿瘤的 18%3。在我国 , 乳腺癌是十大恶性肿瘤之一 , 其发病率呈低龄化和逐年上升趋势 4, 已经严峻要挟妇女的健康。雌激素 (estrogen, E) 在乳腺癌的发生进展进程

13、中发挥着重要作用 , 通过与 ER结合从而激活含雌激素应答元件 (estrogen response element, ERE)的基因 , 阻碍下游靶基因的转录、 翻译和表达水平5,进而阻碍细胞的增殖与分化。GA9可能是一种 ER共调剂因子 ,为了进一步研究它的生物学功能 , 咱们利用 GSTGA9(1 228aa)和 GSTGA9(229456aa)包涵体蛋白 , 经多次尿素洗脱杂蛋白后 ,免疫小鼠成功地制备了特异性好的抗 GA9的抗体 ,从以上结果显示 ,利用 GSTGA9(229456aa)制备的抗体免疫成效较好,而利用 GSTGA9(1228aa)制备的抗体免疫成效相对较差 ,但两抗体

14、的特异性都专门好。将pcDNA3FLAGGA9与空载体 pcDNA3 FLAG别离转染 293T 细胞后 , 用自制的抗体进行 Western blot 分析说明 , 转染空载体的 293T 细胞中并未检测到条带 , 而转染 pcDNA3 FLAG GA9的 293T 细胞中那么检测到与用FLAG 抗体检测的条带位置相同的条带,说明制备的该多克隆抗体能够特异地与 GA9蛋白反映。该抗体的成功制备为下面工作的展开提供了重要的条件 , 为尔后研究 GA9的内源性表达散布、 功能区域定位、与其他蛋白质间彼此作用、 与乳腺癌发生关系等奠定了基础。【参考文献】1Klinge CM. Estrogen r

15、eceptor interaction with estrogen response elements J. Nucleic Acids Research, 2001, 29(14): 2905-2919.2丁丽华 , 袁斌 , 严景华 , 等. FHL1 抗体的制备与鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志 , 2006, 22 （6）: 804-806.3 Bershtein LM, Poroshina TE, Zimarina TS, et al.Expression of estrogen receptoralpha and beta in primarybreast neoplasms and tumors exposed to neoadjuvant hormonaltherapy J. Bull Exp Biol Med, 2004, 138(5): 494-496.4 Aranda A, Pascual A.