地蚕指纹图谱的初步研究

1、地蚕指纹图谱的初步研究【摘要】目的建立地蚕药材的反相高效液相色谱RP-HPL指纹图谱研究方法。方法高效液相色谱法，Lihrspher18柱5，4.6250，乙腈-0.25%磷酸水梯度洗脱,流速1.0l/in，检测波长350n，柱温35。结果10批药材共标定了25个共有峰。结论利用地蚕RP-HPL指纹图谱分析方法较全面地反映地蚕药材的内在质量，可用于地蚕药材的质量控制。【关键词】地蚕指纹图谱地蚕又名肺痨草，为唇形科水苏属植物地蚕Stahysgebbyis.Y.u的全草及地下局部，主产于浙江、江西、福建等地。该药味淡，微甘，性平，归肺、肾经，具有益肾润肺、滋阴补血、清热除烦等功能，用于治疗咳嗽、哮

2、喘等1，化学研究2报道其有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、齐墩果酸等成分。杨中林等3以金丝桃苷为对照品高效液相色谱HPL法测定地蚕药材含量。但对地蚕的质量控制方面的研究较少。为了进一步对地蚕药材质量进展科学评价，本实验采用HPL法对不同产地不同采集时间的地蚕进展指纹图谱的研究，同时进展了系统适应性实验和方法学考察，为地蚕药材的鉴定与质量评价提供根据。1仪器与试药1.1仪器日本岛津L-20AB高效液相色谱仪(PDA检测器,L-slutin色谱工作站。1.2试药金丝桃苷对照品(南京青泽医药开发，含量测定98.48%，批号070415)；地蚕药材经江苏省药品检验所董小平主任药师鉴定；乙腈(色谱纯

3、,山东禹王实业)；冰醋酸(分析纯，南京化学试剂)，水二次重蒸水经过0.45水系滤膜过滤。2方法与结果2.1色谱条件色谱Lihrspher18柱(5,4.6250)，检测波长为350n，进样量10l，柱温35，流速1.0l/in，流动相梯度如表1，记录时间为100in。此条件下对照品金丝桃苷的保存时间18.773in。2.2供试品溶液的制备精细称定粉碎后的地蚕样品约5g，参加75l甲醇，回流30in，滤过，将药液浓缩至干，用少量水溶解，分别用石油醚和醋酸乙酯依次萃取，醋酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容于5l量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。表1流动相梯度2.3对照品溶液的制备精细称取金丝桃苷对照品1g

4、，用甲醇溶解，定容于25l量瓶中(浓度为40g/l)，摇匀即得。2.4方法学考察取地蚕样品进展指纹图谱预试验，按上述色谱条件，可得到别离度较好、各峰分布较均匀的指纹图谱，并着重选择了地蚕峰面积较大的13个峰，进展方法学考察。2.4.1精细度实验精细汲取供试品溶液10l，按上述色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。结果说明，各色谱峰的相对保存时间和其相对峰面积比值根本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱色谱技术要求。2.4.2稳定性实验取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24h进样检测，记录色谱图。结果说明，各色谱峰的相对保存时间和相对峰面积比值根本一致，RSD均小于

5、3.0%，说明供试品溶液在24h内稳定，符合指纹图谱技术要求。2.4.3重复性实验分别精细称定同一批药物5份，同法制备样品，进样，记录色谱图。结果说明，各色谱峰的相对保存时间和相对峰面积比值根本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱技术要求。2.5指纹图谱及技术参数42.5.1指纹图谱选择及特征峰的标定根据10批供试品HPL图谱，选择7号供试品作为对照指纹图谱见图1。地蚕药材中金丝桃苷为其主要成分，从指纹图谱中可以看出金丝桃苷色谱峰保存时间RT18.833in，峰面积百分比A%20.05%积分面积最大，作为参照峰，同时得到各批次地蚕药材25个共有峰。图1地蚕药材的对照指纹图谱2.5.2地蚕指

6、纹图谱相似度计算按上述实验方法检测10批地蚕药材的指纹图谱见图2，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版，国家药典委员会)计算10批药材的相似度，结果分别为：0.980，0.925，0.945，0.972，0.986，0.978，1.000，0.991，0.968，0.967。图210批地蚕药材的指纹图谱2.5.3共有峰相对保存时间及相对峰面积的比拟参照?中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)?4，对地蚕药材进展HPL色谱指纹图谱测定分析，以参照物金丝桃苷(2号峰)的保存时间和峰面积为1，计算10批指纹图谱中25个共有峰的相对保存时间及相对峰峰面积。见表23。表210批供试品共有特征指纹峰

7、相对保存时间3讨论3.1样品来源10批地蚕药材均源于唇形科植物地蚕Stahysgebbyis.Y.u全草；产地14批药材产自浙江省平阳县，58批药材产自浙江省雁荡山，9、10批药材产自江苏省徐州市。3.2色谱条件的考察5考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸多种流动相系统，其中乙腈-水-冰醋酸系统色谱峰别离度好，应选用。乙腈-水-冰醋酸系统中又考察了0.1%，0.5%，0.25%3种冰醋酸浓度，发现冰醋酸浓度为0.25%时色谱峰别离度最好，应选用。根据二级管阵列检测器检测结果，大局部成分在280n和350n时吸收值大，但280n下干扰强，基

8、线不平稳；350n下各色谱峰别离好、基线平稳，故采用350n为检测波长。本实验曾采用等度洗脱，由于成分复杂，时间过长，改用梯度洗脱，同时保证大局部色谱峰都能在100in内出峰。表310批供试品共有特征指纹峰峰面积3.3样品制备条件的考察考察了无水乙醇、95%乙醇、甲醇、75%甲醇、50%甲醇等5种提取溶剂，以色谱峰数量、面积、别离度各因素综合考察，无水乙醇作提取溶剂的样品峰个数最少，其他溶剂提取效果相近，但经放置后发现除甲醇作提取溶剂的样品之外，其他样品均有不同程度的沉淀，最后选用甲醇作提取溶剂。然后考察了超声、回流及索氏提取3种方法，各样品色谱图根本一致，但回流法提取的样品峰面积最大，故采用

9、回流法。接着分别考察了回流30in，1h，1.5h对样品色谱峰的影响，结果各样品色谱图一致，考虑节省能源选用回流30in。采用甲醇热回流提取后，需分别用石油醚和醋酸乙酯萃取，除去极性较大和极性较小的成分，富集黄酮类化合物。3.4参照物确实定由于地蚕药材黄酮类成分的报道有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，实验发现金丝桃苷含量较高，且该色谱峰别离度好，应选用金丝桃苷。3.5不同产地药材指纹图谱相似度评价10批不同产地地蚕药材样品的指纹图谱根本一致，因此选择7号样品的指纹图谱作为对照指纹图谱，由各批次地蚕药材指纹图谱与对照指纹图谱相似度计算结果可见，10批样品指纹图谱相似度良好r0.90,反响药材的同源性。本方法稳定、可靠、重复性好，可为地蚕原药材及其制剂质量标准的拟定提供根据。【参考文献】1?中药辞海?编审委员会.中药辞海.北京：中国医药科技出版社，1993：1948.2张中朋，杨中林，唐登峰，等.地蚕化学成分的别离与鉴定J.中成药，2022，2612：1051.3YangZL,TangDF,hengQH,etal.TheparedstudyfHyersideinthe