工业生物催化剂市公开课获奖课件

1、第四章工业生物催化剂小组组员：陈丽兰、杨欢、祁海平、叶欣、刘文虎第1页第1页Contents4.1概述 4.2酶制剂工业 4.3工业酶制剂应用 4.4酶制剂改性和提升4.5工业生物催化前景4.6参考文献 第2页第2页1.1生物催化剂概念 生物催化剂是由生物合成含有催化作用物质。 现阶段工业上应用生物催化剂包括生物体（微生物）和酶类。 微生物是最惯用活细胞催化剂,酶催化剂则是从细胞中提取出来,只在经济合理时才被应用。1概述第3页第3页1.2生物催化剂与化学催化剂比较与老式化学催化剂相比，生物催化剂含有长处：（1）常温常压、近于中性条件下进行，因而投资少、能耗低、操作安全；（2）极高催化效率和反应

2、速度，比化学催化剂催化效率高1071013倍；（3）高度专一性（包括底物专一性和立体专一性），能有效催化普通化学催化剂难以催化手性反应；（4）本身是微生物和蛋白质，易于生物降解，是抱负绿色催化剂缺点：（1）稳定性较差（易受热、受一些化学物质及杂菌破坏而失活）；（2）反应时对温度和pH范围要求较高。1概述第4页第4页1.3工业生物催化剂应用现实状况 生物催化应用于大规模工业生产是从20世纪60年代开始，在几十年发展过程中，工业生物催化取得了长足进步，利用生物技术生产工业产品逐年增长。典型产品：1概述第5页第5页2.1酶几种主要生产办法（1）提取法 提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动植物

3、组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来。 酶提取是指在一定条件下，用适当溶剂处理含酶原料，使酶充足溶解到溶剂中过程。主要提取办法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。2酶制剂工业第6页第6页（1）提取法 提取分离法特点：设备较简朴；操作较以便；起源受到限制，不适于大规模工业生产。（动植物生产周期长易受地理、气候和季节等原因影响。） 20世纪50年代以后，伴随发酵技术发展，许多酶都采用生物合成法进行生产。然而，在动、植物或微生物组织、细胞中提取所需酶，仍然有其使用价值，至今仍然使用。比如，从动物胰脏中提取分离胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶；从柠檬酸发酵后得到黑曲霉菌体中提取分离

4、果胶酶等。2.1酶几种主要生产办法第7页第7页（2）生物合成法 生物合成法生产用酶首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法取得优良产物工程菌。然后在生物反应器中进行细胞培养，经过细胞反应条件优化，再经过度离纯化得到人们所需酶。 利用微生物细胞生命活动取得所需酶方法又称为发酵法，依据细胞培养方式不同，发酵法能够分为液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞发酵、固定化原生质体发酵等。现在普遍使用是液体深层发酵技术。2.1酶几种主要生产办法第8页第8页2.1酶几种主要生产办法（2）生物合成法 酶工艺生产过程：原料选择；菌种选育和发酵（固体培养与液体深层培养法）；酶制剂生产下游工程。第9页第9页第

5、10页第10页2.1酶几种主要生产办法（2）生物合成法发酵制取酶制剂长处：种类繁多,但凡动植物体内有酶几乎都能从微生物中找到,并可依据应用特点和要求,筛选出最佳产酶菌株；繁殖快,发酵周期短,培养简便,能通过控制培养条件大幅度提升酶产量；微生物含有较强适应能力,可采用各种遗传变异手段,哺育出新、更抱负菌株。第11页第11页（3）化学制取法 包括酶化学全合成、酶类似物和模拟酶化学合成。 化学合成法证实了酶等化学本质是蛋白质,也阐明人们能够通过化学办法在试验室中合成包括酶在内各种生命物质。 化学制取法和提取法同样，由于原料起源受限制,生产成本高,污染环境,难以实现工业化生产。2.1酶几种主要生产办法

6、第12页第12页2.2提升酶产量办法 （1）添加诱导物 对于诱导酶发酵生产，在发酵过程中某个适宜时机，添加适宜诱导物，能够明显提升酶产量。比如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶生物合成等。 诱导物普通能够分为3类： 酶作用底物 酶催化反应产物 作用底物类似物第13页第13页2.2提升酶产量办法 （2）控制阻遏物浓度 据阻遏作用机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用产物或者代谢路径末端产物引发阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用碳源等物质经过度解代谢而产生物质）引发阻遏作用。 控制阻遏物浓度是

7、解除阻遏、提升酶产量有效办法。 第14页第14页2.2提升酶产量办法 （2）控制阻遏物浓度 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用碳源浓度。 对于受代谢路径末端产物阻遏酶，能够通过控制末端产物浓度办法使阻遏解除。 采用其它较难利用碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量环腺苷酸（cAMP）第15页第15页2.2提升酶产量办法 （3）添加表面活性剂 表面活性剂能够与细胞膜互相作用，增长细胞透过性，有助于胞外酶分泌，从而提升酶产量。 将适量非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、曲通(Triton)等添加到培养基中，能够加速胞外酶分泌，而使酶产量增长。 由于离

8、子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞毒性较大，不能在酶发酵生产中添加到培养基中。 第16页第16页2.2提升酶产量办法 （4）添加产酶促进剂 产酶促进剂是指能够促进产酶、不过作用机理未说明清楚物质。在酶发酵生产过程中，添加适宜产酶促进剂，往往能够显著提升酶产量。 比如，添加一定量植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶产量提升120倍,添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）能够提升糖化酶产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要经过试验确定所添加产酶促进剂种类和浓度。 第17页第17页2.3 酶活

9、性测定 酶活性，是指酶催化一定化学反应能力。 酶活性是研究酶特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时一项不可缺乏指标。 酶活性是用在一定条件下，它所催化某一反应反应初速度来表示。 酶反应速度（指速初度）可用单位时间内单位体积中底物减少许或产物增长量来表示。其单位为mol/s。第18页第18页2.3酶活性测定酶活性测定办法： 酶活性与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、克制剂浓度以及缓冲液种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。 终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再拟定反应物消耗量，或产物形成量，算出酶活性。 连续反应法无需终止反应而是在酶反应

10、过程中用光学仪器来监测反应进行情况。其中以光谱吸取改变更为准确。第19页第19页2.4酶提炼（1）酶溶液制取 酶溶液制备包括三个过程工作：材料预处理和破碎细胞；抽提；抽提液浓缩。酶蛋白分布：胞外酶、胞内酶（溶酶、结酶）第20页第20页第21页第21页2.4 酶提炼（2）依据分子大小轻重建立分离纯化办法透析和超出滤；离心分离；凝胶过滤等。第22页第22页2.4酶提炼（3）调整溶解度分离方法调整溶解度分离方法是依据酶和杂蛋白质在溶解度性质上不同而建立一些方法。盐析法；有机溶剂沉淀法；共沉淀法；选择性沉淀法等。第23页第23页2.4 酶提炼（4）按分子电荷正负多少设计分离办法 分子荷正电多物质，与荷

11、负电性物质反应强，受负电场影响大；荷负电性多物质正相反。吸附互换分离法；电泳分离法；聚焦层析法等。第24页第24页2.4酶提炼（5）依据亲和作用建立纯化办法 由于酶对底物、竞争性克制剂、捕酶等配体含有较高亲和力，而其它杂蛋白对它们没有或有很弱亲和作用。因此，能够依据酶、杂蛋白对配体亲和力差别，很容易地将酶分离出来。 已建立办法有亲和层析、亲和电泳法等。第25页第25页2.4 酶提炼（6）其它依据稳定性差别建立分离纯化办法：热变性法、酸碱改变法和表面变性法等。蛋白质(酶)高效液相色谱分离分析法。第26页第26页2.5 固定化酶 以往使用酶绝大多数是水溶性酶。这些水溶性酶催化结束后，很难回收，因而

12、阻碍了酶工业近一步发展。 60年代以后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。 它是通过物理或化学手段，将酶束缚于水不溶载体上、或将酶束缚在一定空间内，限制酶分子自由流动，但能使酶充足发挥催化作用。第27页第27页2.5 固定化酶（1）酶固定化办法：吸附法；包埋法；共价键结合法；交联法。第28页第28页第29页第29页2.5 固定化酶（2）固定化酶性质 酶活性改变：与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。 （原因：酶与不溶性载体相结合引发结构发生了改变；酶活性中心主要氨甚酸残基与载体相结合。） 稳定性改变：大多数酶在固定化后都不同程度地提升了稳定性，延长了有效寿命。 （原因：固定化增加了酶构象牢固程

13、度。挡住了不利原因对酶侵袭。限制了酶分子间相互作用。不过，假如固定化触及到酶活性敏感区域，也可能造成酶稳定性下降。） 最适pH改变 最适温度改变 动力学常数改变第30页第30页2.6 固定化酶反应器（1）固定化酶反应器类型间歇式酶反应器（Batch Reactor，BSTR）底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完毕后，固定化酶用过滤或超滤法回收，再转入下一批反应。长处：装置较简朴，造价较低，传质阻力很小，反应能快速达到稳态。缺点：操作麻烦，酶经多次重复回收使用后易失去活性，工业上很少用于固定化酶，惯用于游离酶。第31页第31页2.6 固定化酶反应器连续搅拌釜式反应器（Continu

14、ous Stirred Tand Reactor，CSTR）向反应器投入团定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定流速连续流人底物溶液，同时，以相同流速输出反应液(含产物)。长处：在抱负情况下，混合良好，各部位构成相同，并与输出成份一致。缺点：搅拌浆剪切力大，易打坏磨损问定化酶颗粒。第32页第32页2.6 固定化酶反应器填充床反应器（Packed Bed Reactor，PBR）将固定化酶填充于反应器内，制成稳定柱床，然后通入底物溶液，在一定反应条件下实现酶催化反应，以一定流速，搜集输出转化液(含产物)。长处：高效率、易操作、结构简朴等，因而是当前工业生产及研究中应用最为普遍反应

15、器。缺点：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。其它流化床反应器（Fluidized Bed Reactor，FBR）；连续搅拌罐-超滤膜反应器（CSTR-UFR）等。第33页第33页2.6 固定化酶反应器（2）固定化酶反应器选择 影响酶反应器选择原因诸多但普通从下列几种方面考虑：固定化酶形状；底物物理性质；酶反应动力学特性；酶稳定性；操作要求及反应器本身代价等。第34页第34页3 工业酶制剂应用3.1 1,3-丙二醇 1,3-丙二醇（1,3-propanediol，PDO）是一个主要化工原料，由PDO合成聚酯如聚对苯二甲酸二醇酯（PTT）等含有良好性能

16、和辽阔工业化前景。 主要用途：作为产品中组分提升产品性能，如化妆品、抗冻剂等；作为医药和有机合成中间体用于食品、化妆品和制药等行业，如合成增塑剂、防腐剂、乳化剂、香味增强剂等；作为单体用于合成聚酯和聚氨酯，是PDO最主要用途。第35页第35页3 工业酶制剂应用（1）1,3-丙二醇化学合成办法 PDO有各种合成办法，主要由环氧乙烷羰基化法和丙烯醛水解法。 环氧乙烷（EO）羰基化法EO+CO+2H2PDO 反应压力大，装置投资较大。 丙烯醛水解法CH2=CHCHO+H20 HOCH2CH2CHOHOCH2CH2CHO+H2HOCH2CH2CH2OH 丙烯醛本身也是一个主要有机中间体，且属剧毒、易燃

17、、易爆物品，难以储存和运送。第36页第36页3 工业酶制剂应用（2）1,3-丙二醇发酵法 以葡萄糖为底物经由甘油生产，技术中使用克隆了肺炎克雷伯菌中dha调整因子大肠杆菌（基因工程菌）。 由甘油到PDO反应过程中，一部分底物甘油通过还原路径，经甘油脱水酶和PDO氧化还原酶催化，得到PDO；另一部分甘油通过氧化路径供菌体生长需要，并提供还原所需NADH2。 催化过程需要与菌体生长耦合在一起多个酶协调作用，并且菌体在含有生物活性时候，才干确保足够还原当量和一些辅酶再生，最后确保催化反应顺利进行。第37页第37页第38页第38页3 工业酶制剂应用3.2 L-异亮氨酸 异亮氨酸(2-amino-3-m

18、ethylvalericacid)由Ehrlich于19初次从甜菜糖浆中分离出来,其化学构成虽与亮氨酸相同,但理化性质各异,故命名为异亮氨酸。 异亮氨酸有4种光学异构体,自然界中存在仅为L-异亮氨酸。 作为人体必需8种氨基酸之一,成年人天天需要从外界摄取20mg/kg(体重)L-异亮氨酸。 L-异亮氨酸是合成人体激素、酶类原料,含有增进蛋白质合成和克制其分解效果,在人体生命活动中起着主要作用,因此,在食品和医药行业含有广泛应用及商业价值。第39页第39页3 工业酶制剂应用（1）L-异亮氨酸生产办法 L-异亮氨酸生产办法有提取法、化学合成法、发酵法。 提取法和化学合成法由于原料起源受限制,生产成

19、本高,污染环境,难以实现工业化生产。 微生物发酵法生产L-异亮氨酸含有原料成本低,反应条件温和,容易实现大规模生产等长处,是当前生产L-异亮氨酸最主要办法。 L-异亮氨酸发酵有添加前体发酵（又称微生物转化法）和直接发酵-种办法。第40页第40页3 工业酶制剂应用（2）L-异亮氨酸生物合成路径 以葡萄糖为原料生物合成L-异亮氨酸涉及到EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、伍德沃克曼反应,以及苏氨酸合成水平和分支链氨基酸合成水平调控制,其生物合成路径如图1所表示。第41页第41页第42页第42页3 工业酶制剂应用3.3酶制剂其它工业应用（1）果葡糖浆（2）丙烯酰胺（3）手性化合物等第43页第43页4

20、 酶制剂改性和提升4.1改性目的、意义 伴随丙烯酰胺、长链二元酸等大宗产品逐步走向市场，许多关于生物催化技术摸索研究也广泛地开展起来，并在一些领域取得了可喜结果。 但是，当前工业酶催化生产过程还是比较有限，主要原因在于：酶种类少；当前酶活性、耐温性、耐酸碱改变等性能比较差。 利用生物技术对既有酶进行改性研究，提升酶活性和耐久性，拓宽了工业生物催化剂应用领域，使其更有工业应用前景。 近年来，这方面工作研究主要集中在极端菌摸索，非水相酶研究以及分子水平定向进化、合理化设计等。 第44页第44页4.2改性手段（1）极端菌研究 近年来，人们发觉一些菌在高温、严寒、强酸碱、高盐浓度、高压等普通生物无法生

21、存极端条件下任然能够生存，这些菌统称为极端菌。 对这些极端菌进行研究，有望逐步处理工业微生物对温度和环境依赖性等缺点，增强在工业上应用前景。 极端菌包括嗜高温菌、嗜低温菌、嗜盐菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜压菌等。第45页第45页4.2改性手段（1）极端菌研究 嗜高温菌当前在工业上能够有两种用途： 一是利用菌体产生酶进行高温下反应。如嗜热古细菌Thermusaquoticus中分离出来得TaqDNA聚合酶能够用于PCR技术。 二是利用菌体发酵。如用极端嗜热菌生产乙醇，在高温下进行这一反应，能够把生产和分离结合起来，消除乙醇产物克制作用。 其它极端菌在发觉地和结构上也各有特点，决定了它们不同工业用途。如

22、因为嗜盐菌在高盐浓度下稳定，它可用作低含水体系催化剂。第46页第46页4.2改性手段（1）极端菌研究 另一方面，利用基因工程技术将极端微生物特殊功能基因片段转入一般微生物体内或将一般微生物特异基因片段导入极端微生物中，从而改造受体生理功能，甚至创造新物种也是一种较好利用极端菌办法。第47页第47页4.2改性手段（2）非水相酶催化水是酶促反应最惯用反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一个适宜溶剂。由于许多有机化合物（底物）在水介质中难溶或不溶。由于水存在，往往有助于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应发生。是否存在非水介质能确保酶催化？第48页第48页4.2改性手段（2）非水相酶催化 1

23、984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应研究，他们成功地在利用酶有机介质中催化作用，取得酯类、肽类、手性醇等各种有机化合物，明确指出酶能够在水与有机溶剂互溶体系中进行催化反应。第49页第49页4.2改性手段（2）非水相酶催化酶非水相催化几种类型：有机介质中酶催化气相介质中酶催化超临界介质中酶催化离子液介质中酶催化第50页第50页4.2改性手段（2）非水相酶催化酶在有机介质中因为水分子降低，相对来说酶分子构象表现出比水溶液中更含有“刚性”特点。因而使经过选择不同性质溶剂来调控酶一些特性成为可能。比如在有机溶剂中，能够利用酶与配体相互作用性质，诱导改变酶分子构象，调

24、控酶底物专一性,、立体选择性和手性选择性等。由于引起酶变性许多原因都与水存在相关, 因此在有机介质中酶稳定性得到明显提升。由于有机溶剂存在, 水量减少，大大减少了许多需要水参与副反应，如酸酐水解、氰醇消旋化和酰基转移等。在有机介质中进行酶促反应，能够省略产物萃取分离过程, 提升收率。第51页第51页4.3酶改性两种办法（1）合理设计 基于对蛋白质结构、功效和机制详细理解，能够预先思考出氨基酸序列准确地改变，然后通过定点突变办法引入这些改变。长处：能优化所需性质，极大地提升对于酶结构与催化机制结识。缺点：由于对提升酶性质内在机制不够理解等原因，多数试验是失败。第52页第52页4.3酶改性两种办法（2）定向进化 定向进化不需要关于酶结构与功效关系结识，采用一个随机过程产生一个巨大变异基因库，然后通过基因选择或者高通量筛选办法拟定出含有性质改进变异型。 模拟自然进化关键环节突变、重组和筛选，在较短时间内完毕漫长自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类需要。第53页第53页4.3酶改性两种办法（3）合理设计与定向进化比较合理设计定向进化蛋白质结构知识需要不需