靶向抑制PI3KAkt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响

1、靶向抑制PI3K/Akt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响【摘要】目的研究LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路对线粒体激活因子Sa基因的表达及胃癌细胞凋亡的影响。方法将PI3K/Akt信号通路的靶向抑制剂LY294002参加胃癌细胞株SG7901,四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖,DNAladder检测细胞凋亡,原位细胞凋亡检测技术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,免疫组织化学检测Sa的表达。结果LY294002致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关。在DNA电泳图上,对照组呈规那么的基因组断裂条带,其亮度与药物作用时间呈正相关。流式细胞结果显示LY2940002处理

2、后在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,作用12h时,细胞凋亡达58.7%。Sa在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达；LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染。结论PI3K/Akt信号通路、Sa基因与胃癌细胞的凋亡关系亲密。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株胃癌细胞系SG7901由本实验室传代培养,含10%小牛血清(美国SIGA公司)的RPI1640培养基,在37培养箱中培养,23d更换培养基1次1.1.2实验试剂Sa多克隆抗体(美国Santaruz公司)；PI3K抑制剂LY294002美国Prega公司；流式细胞仪ulter,EpiusELITE,ESP,美国)。1.2方法

3、1.2.1LY294002溶液的配置按照配制说明书先将LY294002干粉5g充分溶解于二甲基亚砜diethylsulfxide，DS溶液325L中,配制成50l/L的LY294002溶液,移入-20冰箱储存,用前稀释成所需的浓度。1.2.2四甲基偶氮唑蓝TT法检测细胞生长活性选择对数生长期细胞,接种于96孔培养板,另设不加细胞的培养液为对照组。实验组分别给予终浓度为10,30,50l/L的LY294002DS0.05%,对照组参加同等浓度的DS,每孔设3个复孔。再培养4,8,12h,每孔分别参加5g/L的TT10L。加DS100L,振荡。用酶标仪在波长490n处测每孔光吸收值D,重复3次。计

4、算：细胞存活率%=D试验组/D对照组100%。根据TT结果选择出干预浓度和时间。1.2.3DNALadder检测搜集各组细胞,用PBS重悬,参加细胞裂解液(1%NP40,20l/LEDTA,50l/LTris)400L,反响10in,离心搜集上清,参加十二烷基硫酸钠(SDS)至1%浓度,参加RNA酶在56作用1h,参加蛋白酶K37处理过夜,乙醇沉淀DNA,TE溶解DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并拍照。1.2.4原位细胞凋亡检测技术TUNEL检测细胞凋亡将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,取对数生长期细胞。待细胞长满后,给予终浓度为10,30,50l/L的LY294002DS0.05%,

5、分别培养4,8,12h后,取出盖玻片,用4%多聚甲醛溶液固定,并与阻断剂室温孵育30in。PBS洗片,与通透液在冰浴中孵育2in。滴加TUNEL反响混合溶液50L,在湿盒中37孵育。参加转化剂(PD)50L,在37湿盒中孵育30in。参加DAB底物溶液50100L，封片,在光镜下分析结果：细胞凋亡指数=凋亡细胞数倒置显微镜计数200个细胞1.2.5流式细胞仪检测调整待测细胞的密度。设置对照组及观察组。搜集细胞,70冷乙醇固定24h,10g/LRNaseA37温育30in后,加碘化丙啶(PI)使其终浓度达20g/L,暗处作用0.5h。1.2.6胃癌细胞SG7901Sa表达的检测将细胞接种在放有盖

6、玻片的6孔板内,当盖玻片面上的细胞长至70%80%交融时,参加终浓度为50l/L的LY294002,不加药物作为对照组,培养4,8,12h,小心取出长有细胞的盖玻片,4冷丙醇固定,按试剂说明行SP法免疫组织化学染色,用PBS代替一抗作为阴性对照片。采用Gatalia等的半定量积分法计算5。2结果2.1TT法检测胃癌细胞增殖随着不同浓度LY294002作用时间延长,细胞的存活率呈逐渐下降趋势(P0.05，表1。表1四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率略Tab1ellviabilityfSG7901ellsafterexpsurefLY294002(1050l/L)fr4,8,12h同一浓度LY29

7、4002干预不同时间相比拟,#：P0.01；：P0.01.2.2胃癌细胞凋亡结果2.2.1DNALadder结果对照组呈规那么的基因组断裂条带,50l/L的LY294002作用4,8,12h后,均可见180200bp的梯型条带,其亮度与药物作用时间呈正相关。随着LY294002作用浓度增加,胃癌细胞凋亡增加图1。2.2.2TUNEL检测结果50l/LLY294002作用4,8,12h,细胞的凋亡指数上升,且在同一时间点上,随着干预浓度增加,细胞凋亡指数升高；在同一浓度点上,随着作用时间延长,细胞凋亡指数升高表2,图2。图1DNALadder电泳图略Fig1DNALadder表2TUNEL法检测

8、细胞凋亡指数略Tab2ellappttiindexfSG7901ellsafterexpsurefLY294002(1050l/L)fr4,8,12h不同浓度LY294002干预一样时间相比拟，#：P0.01；同一浓度LY294002干预不同时间相比拟，：P0.01.转贴于论文联盟.ll.2.3胃癌细胞增殖周期改变同一浓度LY2940002处理SG7901细胞不同时间,在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,50l/LLY294002处理8h时,凋亡细胞就达33.7%；12h时,凋亡细胞达58.7%图3。2.4LY294002对Sa蛋白表达的影响Sa蛋白表达于细胞质内,呈淡黄色或棕黄色分布,在胃癌

9、细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达(2=36.246,P0.05)；经LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染表3,图4。表3同一浓度LY294002作用不同时间后Sa蛋白表达变化略Tab3TheexpressinfprtEinSaafterexpsurefLY294002(1050l/L)fr4,8,12h箭头所指为阳性细胞.A：对照组；BD：10l/L作用4,8,12，随作用时间延长，阳性细胞粒增加h；EG：30l/L作用4,8,12h，阳性细胞粒与作用时间成正比；HJ：50l/L作用4,8,12h，作用时间越长，凋亡细胞越多.图2TUNEL法检测胃癌细胞凋亡略Fig2TUNELanalysisAP：凋亡细胞；A：对照组；BD：LY29400250l/L作用4,8,12h.图3流式细胞检测不同浓度LY294002干预SG7901细胞凋亡略Fig3Flytetryanalysisabutapptsis箭头所指为阳性细胞.A：4h；B：8h；：12h,作用时间延长，细胞质着色增加.图4LY294002对Sa蛋白表达的影响(400)略Fig4TheeffetfLY294002ntheexpressinfprtEInSa(400)3讨论3.1PI3K/Akt信号