海洋生物技术第七章 基因工程的下游技术

1、第七章 基因工程下游技术内容提要第一节 基因工程菌生长代谢的特点第二节 基因工程菌的不稳定性第三节 基 因 工 程 菌 中 试第四节 重 组 工 程 菌 的 培 养第五节 高密度发酵第六节 基因工程药物的分离纯化第七节 变性蛋白的复性第八节 基因工程产品的质量控制第九节基因工程产品制造实例第一节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长常用比生长速率（每小时单位质量的菌体所增加的菌体量）表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法控制菌体的生长。 控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体

2、的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。一、菌体的生长与能量的关系菌体生长由呼吸控制，碳源决定菌体在该培养基的最大比生长速率。菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，菌体产生的代谢副产物乙酸抑制菌体的生长。在高密度培养时，提高培养基pH可减弱乙酸的作用。分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等，通过降低供能速度和前体供应速度，在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。实质： 控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰

3、辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。 大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。二、菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。 基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，导致工程菌生长速率降低。 质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程

4、菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。它通过影响RNA链的延深过程减少转录。 (1)ppGpp四磷酸鸟苷（在G的5和3位点各附着两个磷酸） (2) pppGpp五磷酸鸟苷（鸟苷5一三磷酸-3二磷酸）。 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。基因工程菌在

5、传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。一、质粒的不稳定性第二节 基因工程菌的不稳定性质粒不稳定产生的原因分裂不稳定、结构不稳定二种类型（1）含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（2）两种菌的比生长速率差异的大小 （质粒拷贝数低/高）质粒稳定性的分析 将工程菌培养液样品适当稀释，在不含抗性标记的平板培养基培养10-12h，随机选100个菌落接种到含抗性标记的培养基培养10-12h，统计长出的菌落数，计算比值ST（stability）二、提高质

6、粒稳定性的方法（1）选择合适的宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等。（2）选择合适的载体低拷贝质粒工程菌不含质粒子代频数大高拷贝质粒工程菌比生长速率低于不含质粒菌调控比生长素率可改变质粒拷贝数（3）两阶段培养法 使菌体生长至一定密度 诱导外源基因的表达（4）在培养基加入选择性压力 （加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长）（5）控制培养条件 （温度、pH、培养基组分、溶解氧浓度）（6）固定化第三节基 因 工 程 菌 中 试中试应考虑的问题 适合商品化生产的工程菌设计发酵反应器选择反应过程发酵培养基组分维持生产工艺最佳化的方法工艺监测、控制、自动化使用

7、方法生物催化剂的使用产品分离、纯化方法一、工程菌选择（条件）能用一般基因重组技术获得有高产潜力能以工业原料（碳源）为培养基生产工艺能用一般工业生产经验能产生、分泌蛋白质不致病、无毒性生产安全，符合国家卫生部门规定代谢能控制产品有特异性发酵液黏度小二、反应器（发酵罐）设计符合生物反应与化学工程的需要设计前的生物数据：培养细胞系特性、细胞生长率、发酵罐消毒方法、温度、溶氧、pH、CO2、代谢产物、后处理效果等。设计要求：能连续发酵和分批发酵；附有加料管、取料管、测量仪表；易安装与移动；仪表数据可靠，重现性好；可任意装置附件；罐体为不锈钢、光滑。三、发酵培养基组成提供化学元素：C、N、O、H、P、微

8、量元素、金属离子等提供特殊营养：氨基酸、维生素等提供能源：葡萄糖等控制代谢：加入活性物质、改变温度和pH等四、工艺优化与参数监控优化工艺：周期短、产量高、质量好、消耗低、安全性高、废物处理周全、速度快、失败率低等综合指标。监控数据：1）主要参数：pH、温度、溶氧、CO22）生物量：浊度、细胞组分、总氮量、菌丝干重3）碳源：糖、有机酸、乙醇、淀粉、脂质4）产品五、计算机的应用优化生产工艺降低劳动强度自动化第四节重 组 工 程 菌 的 培 养基因工程菌的培养过程（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条 件（温度、pH、培养基组分及C/N）， 分析表达产物的合成、积累对受体细 胞的影响。（2）培养罐操

9、作：确定培养参数、控制方 案及顺序。一、基因工程菌的培养方式（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。溶氧、流加补料（2）连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性（5）分批培养DO-Stat法：调节搅拌转速和通气速率控制DO （溶氧）在20%

10、，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat法：控制溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。控制菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。二、基因工程菌的培养工艺基因工程菌发酵工艺的影响因素（1）培养基的影响（C、N、无机盐、维生素、微量元素等）常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 （2）接种量的影响（取决于菌种在发酵中的生长繁殖速度）接种量是指移入的种子液体和培养液体积的

11、比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。（4）溶解氧的影响（调节搅拌转速前期低/后期高）溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 （5）诱导时机的影响（温度、氧、营养）一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。（6）pH的影响（细胞生长期、外蛋白表

12、达期）pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。（7）诱导表达程序的影响：热诱导总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。第五节 高密度发酵50gDCW/L200gDCW/L一、影响高密度发酵的因素1.培养基碳/氮 小 菌体生长旺盛碳/氮 大 数量得不到保证2.溶氧浓度提高溶氧的方法：用空气通气系统，提高通气中氧的分压。将透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中。与小球藻混合培养。 3.PH值4.温度生长与表达之间的调节。升温过程的控制。5.代谢副产物乙酸、CO2二、实现高密度发酵的方法1.发酵条件的改进培养

13、基的选择建立流加式培养方式提高供氧能力2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌阻断乙酸产生的主要途径对碳代谢流进行分流限制进入糖酵解途径的碳代谢流引入血红蛋白基因3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第六节基因工程产物的分离纯化基因工程产品的特点（1）目的产物在初始物料中含量较低；（2）含目的产物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差，易失活/变性；（4）生物活性物质种类繁多；（5）应用面广，对质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的生物技术产品的分离纯化工艺。一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素（1）含目的产物的起始物料的特点 菌种类

14、型及代谢特性 原材料和培养基的来源及质量 生产工艺与条件 初始物料的理化特性与生物学特性（2）物料中杂质的种类和性质（3）目的产物特性（4）产品质量的要求二、分离纯化的基本过程分离纯化是基因工程产品生产中极其重要的一环。一般不应超过45个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。分离纯化的一般工艺过程可分为4个阶段，即预处理、提取、精制、成品加工。（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶

15、、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞内产物提取精制三、细胞的破碎方法物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法。化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法。生物破碎法：酶溶法机械破碎珠磨法研磨法匀浆法X-press法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。1 机械破碎法DY89-I型 电动玻璃匀浆机WSK卧式高效全能珠磨机Crushing in ball mill 珠磨法 ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机在高速珠磨机中，圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃珠相互搅动，由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动引起细胞破碎。 Homogenization匀浆法：Xpre

16、ss法将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。主要用于实验室中。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，该法对冷冰融解敏感的生化物质不适用。2 物理破碎法物理破碎干燥法冻融破碎法渗透压破碎法超声波破碎法 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。JY92-II D超声波细胞粉碎机 （1）超声波破碎法超声波破碎仪 超声波破碎机通常在15到25千赫（kHz）的频率下操作，细胞的破碎是由于超声波的空穴作用。这种空

17、穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，进而引起粘附性旋涡，涡旋生成与消失时产生巨大拉力，在介质中的悬浮细胞上造成了剪切力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。（2）渗透压破碎法将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。（3）冻融（冻结融化）法将细胞放在低温下冷冻和室温下融化，

18、反复多次而达到破壁作用。此法适用于细胞壁较脆弱的菌体。此法破碎率低，容易使对冻融敏感的蛋白质变性，因此不适于对冷冻敏感的物质分离。（4）干燥法包括空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。通过改变细胞膜渗透性，再用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理，胞内物质就容易被抽提出来。空气干燥主要适用于酵母菌，一般在25至30的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冰条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。3 化学破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活

19、性剂：Triton、Tween通过各种化学试剂对细胞壁、膜的作用，而使细胞破碎（1）去污剂。如: Trition X-100 ，能溶解细胞膜而使蛋白透过细胞.去污剂能使蛋白变性,在细胞破碎以后必需除去. （2）有机溶剂。例如丙酮等，将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至20的丙酮中搅拌，使细胞脱水。丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。4 酶解破碎酶解破碎自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 酶解法是利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破

20、壁目的。酶解的优点是专一性强，发生酶解的条件温和。 （1）溶菌酶 应用最多的酶，能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-l，4糖苷键，使脂多糖解离。经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。（2）自溶作用 微生物可代谢产生一种能水解细胞壁聚合结构的酶，促进细胞增长。改变微生物的环境（温度、pH等），可诱发产生过剩的自溶酶，以达到自溶目的。微生物细胞的自溶常采用加热法或干燥法。但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。四、固液分离离心沉降重力沉降膜过滤目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。目的

21、产物分离纯化的方法主要依赖色谱分离方法。五、重组蛋白质的分离纯化 产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件相对分子量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间 产物的特性在分离纯化中的作用分离纯化的技术要求：技术条件温和能保持产物生物活性。选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。收率要高。两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。纯化过程要快，满足高生产率的要求。1 色谱分离技术的基本原理色谱分离技术是一类相关分离方法的总称，利用不同组分在两相中物理

22、化学性质的差别，通过两相之间不断的相对运动，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），使各组分以不同的速率移动，原来微小的分配差异被不断放大，从而将各组分分离的技术。将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就称为色谱分析法。2 色谱系统的基本组成分为四个部分：高压输液系统、分离系统、进样系统、检测系统所有的色谱系统都有两个相组成，一个为固定相，一个为流动相。混合物在两相中的分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（K）（平衡系数、吸附系数、选择性系数）。用下式表示

23、： Cs 表示某一物质在固定相中的浓度 K = Cm 表示某一物质在流动相中的浓度 3 分配系数分配系数与被分离物质本身的性质、固定相和流动相的性质、色谱柱的操作温度有关。各组分分配系数的差异程度决定了色谱的分离效果，分配系数差异越大分离效果越理想。4 色谱的基本概念固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。

24、如图所示为一色谱流出曲线：基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。峰高（h）和峰面积（A） ：色谱峰顶点与峰底基线的垂直距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。区域宽度：可用于衡量色谱柱的柱效。宽度越窄，其效率越高，分离的效果越好。色谱分离中的四种典型情况 分离效果差，柱效低，选择性低 完全分离，柱效高，峰窄，选择性低 ；完全分离，选择性增加，柱效低，峰宽完全分离，柱效高，选择性好色谱流出曲线的意义： 色谱峰数等于样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性分析的依据； 色谱

25、峰高或面积定量分析的依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。 理想的洗脱曲线如图所示。图中的峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。色谱峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。表-1 概念、表示方法及计算公式汇总表-25 色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分子分离的色谱方法，有以下几种。柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层色谱：将适当粒度的吸

26、附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。1) 按固定相形态不同分类：纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。2）根据流动相的相态不同分类色谱法液相色谱法气相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法超临界流体色谱法气-液色谱是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质,气-固色谱是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质。 分配色谱：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。吸附

27、色谱：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶色谱：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 亲和色谱法：利用固定相载体表面偶联的具有特殊亲和作用的配基，与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离。3) 按色谱过程的机理分类 凝胶色谱，又称为凝胶过滤、分子排阻色谱或分子筛色谱。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种色谱技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领

28、域。 6 凝胶色谱色谱技术各论 凝胶色谱的基本原理 当含有各种组分的样品流经凝胶色谱柱时，大分子物质分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出色谱柱，而达到分离的目的。离子交换色谱是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。广泛用于生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。7 离子交换色谱色谱技术各论 离子交换色谱技术基本原理 离子交换剂由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子（

29、活性离子）构成，基质与电荷基团以共价键连接，电荷基团与反离子以离子键结合。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+ RB+A+ 亲和色谱是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的色谱技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和

30、色谱，达到分离纯化目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样品中的辅酶分离纯化。 8 亲和色谱 色谱技术各论亲和色谱的示意图生物亲和作用的本质亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚。蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙-锁关系亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用载体配体臂待分离组分亲和吸附洗涤洗脱再 生杂蛋白目的酶亲和分离原理示意图9 高效液相色谱色谱技术各论 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, H

31、PLC)，又称高压液相色谱法 、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，应用广泛。 工作原理：高压泵将贮液罐的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出。当待分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱进行分离，按先后顺序进入检测器，由记录仪记录。二、HPLC的特点 HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。 高压：HPLC是以液体作为流动相，通过色谱柱时所受的

32、阻力比较大，必须施加高压。一般为15-30MPa，最高可达50MPa。 高速：HPLC采用高压后，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多。 高效：HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。 高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。 操作过程演示1配制流动相把二次蒸馏水和色谱纯级甲醇以15：85的比例混合取混合均匀的溶液，经0.45m的有机膜过滤，再脱气15分钟即可操作过程演示2 更换色谱柱 把流动相贮液器放置在略

33、高于高压泵的位置，插入带有不锈钢滤芯的输液管 开启高压泵电源开关，打开排放阀 设置流动相比例和流速等参数 揿下高压泵启动鍵“ON/OFF”，再按“Purge”鍵，仪器开始清洗高压泵和排除管路中的气泡 。 观察废液出口，若没有气泡，按“Purge”鍵，停止排放，关闭排放阀。 打开检测器电源开关，设置检测波长 操作过程演示3仪器运行平衡后，用液相进样针进样，一般为定量管的35倍。工作站对所注射样品进行分析测试，并绘制分离色谱图。 色谱工作站对测试数据进行计算，并将结果在屏幕上显示出来 操作过程演示4液相色谱法分析流程 高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通

34、过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。 高压输液系统 贮液器材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK） 容积：0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 注意：密封、过滤高压输液系统高压输液泵 要求：泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压（3060MPa）下连续工作；输出流量稳定（1%），无脉冲，重复性高（0.5%），而且输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。 类型：一般可分为恒压泵和恒流泵两大类 高压输液系统 流动相过滤与脱气装置 流动相过滤装置 分为在线过滤和真空过滤 流

35、动相脱气装置 分为在线真空脱气和超声波脱气六通阀进样器：用于固定体积进样进样系统六通阀进样示意图进样系统 液相色谱进样针：其针头为平头，以免扎破六通阀管路。用于可变体积进样 自动进样器分离系统 色谱柱 分离系统的主要部件是色谱柱，柱效高、选择性好、分析 速度快是对色谱柱的一般要求。安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。 一般在色谱柱前要求安装保护柱，起到保护延长分析柱寿命的作用。有些物质的分离条件要求有一定的温度，因此，给色谱柱配一个柱温箱是非常有必要的。 检测系统解： 分类通用型：示差折光检测器（RID）、电导检测器（ECD）和蒸发光检测器（ELSD）,它们检测物质总体物理性

36、质的变化情况专用型：紫外检测器（UV-Vis）、荧光检测器（FD）， 它们检测某一物理或化学性质的变化数据处理系统（工作站） 打开工作站，选择工作通道编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法输入路径名、样品名、操作者等样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹。10、纸色谱 （一）原理 滤纸一般能吸收25%29%的水，其中6% 7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，较难脱去。纸色谱实际是以滤纸纤维的结合水为固定相，而

37、以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离的目的。 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值（阻滞因数）表示： Rf= x/ y式中x：溶质斑点中心的移动距离 y：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。 溶剂前沿氨基酸显色点滤纸原点XY（二）纸色谱操作过程 （1）样品处理 用作纸色谱的样品

38、，应尽可能纯化。调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。 （2）点样 将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析用普通毛细管，定量分析用血球计数管或微量注射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的量由纸的长短及样品的性质决定，一般为5-30g。点样采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。 （3）平衡 点样以后展开之前先将滤纸与色谱缸用配好的溶液系统的蒸汽饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤

39、纸和色谱缸未被溶剂蒸汽饱和，在色谱过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，严重影响色谱效果。平衡一般在密闭的色谱缸内进行。 （4）展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。 （5）显色 为了显示色谱斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。 (1) 显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 (

40、2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 （6）定性分析 色谱后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。 （7）定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。

41、 六、非蛋白质杂质的去除 DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖），去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透；脂多糖是阴离子，可用阴离子交换层析除去；脂多糖是疏水性的，可用疏水层析法。病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。七、选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩，可用沉淀和超滤法。细胞内可溶性表达：亲和层析或离子

42、交换色谱。周质表达：渗透压休克法。不溶性表达：离心分离。根据分离单元之间的衔接选择先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。沉淀、超滤、吸附离子交换色谱、亲和色谱凝胶层析。选择合适的分离次序。根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原则：具有良好的稳定性和重复性；尽可能减少组成工艺的步骤；各技术步骤间要相互适应和协调；工艺过程中尽可能少用试剂；工艺所用时间要短；工艺和技术必须高效收率高易操作能耗；具有较高的安全性；第七节 变性蛋白的复性包含体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、

43、外膜蛋白等，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。优点：包含体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小。一、包含体形成的原因表达产率过高。 重组蛋白的氨基酸组成：含硫氨基酸。重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包含体。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白 。蛋白质本身固有的溶解度。蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致包含体的形成。 二、包含体的分离和溶解包含体的分离：重组菌破碎离心沉淀低浓度的变性剂，去垢剂洗涤。包含体的溶解：强变性剂，强去垢剂。盐酸胍，脲，TritonX-100 ，SDS，巯基乙醇，EDTA等。三、包含体蛋白复性的方法理想的复

44、性方法的特点： 活性蛋白质的回收率高。 正确复性的产物易于与错误折叠蛋白分离。 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。 折叠复性方法易于放大。 复性过程耗时少。1.稀释、透析复性法降低重组蛋白的浓度，减少聚集降低变性剂，去垢剂的浓度2.封闭蛋白的疏水簇促进复性3.凝胶过滤层析复性4.小分子添加剂促进的复性5.分子伴侣或折叠酶促进的复性6.人工分子伴侣促进复性第八节 基因工程产品的质量控制 基因工程是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可造成严重危害。 宿主细胞中表达的外源基因，在转录、翻译、精制、工艺放大过程中都可能发生变

45、化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。药品生产质量管理规范（GMP） FDA/SFDA 国家药监局一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点产品安全性评价产品本身的结构严格控制条件二、 生物材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。根据质量控制要求应了解以下特性：明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列确证； 应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物； 应提供宿主细胞的名

46、称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性。须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。三、培养过程的质量控制在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。四、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基

47、成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。五、目标产品的质量控制生物活性物质的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。1.生物活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。2.理化性质的测定 电泳方法: SDS、等电聚焦、免疫电泳。 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA) 受体结合试验。 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分 析、圆二色谱、核磁共振。非特异性鉴别特异性鉴别相对分子质量测定等电点测定肽图分析氨基酸组

48、成分析部分氨基酸序列分析蛋白质二硫键分析3. 蛋白质含量及纯度的分析 染色剂法、SDS、等电聚焦、各种HPLC、 毛细管电泳4.杂质检测蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白采用免疫分析的方法。非蛋白类杂质 病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及DNA。常用检测方法：杂质和污染物 检 测 方 法内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS、CE其它蛋白杂质 免疫分析、SDS、 HPLC、CE残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异 肽谱、HPLC、 IEF、 CE甲酰蛋氨酸 肽谱、HPLC、 IEF、 CE蛋氨酸氧化 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基 SD

49、S、IEF、HPLC、CE、质谱、 凝胶过滤杂质和污染物 检 测 方 法单克隆抗体 SDS、免疫分析氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE微生物 微生物学检查支原体 微生物学检查病毒 微生物学检查5.稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标，是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。6.产品一致性的保证六、产品的保存液态保存低温保存在稳定的PH下保存高浓度保存加保护剂保存固态保存低温冷冻干燥机第九节基因工程产品制造实例 干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。型干扰素在分为1b、2a、2b等亚型。一、基因工程菌的组建诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌