基因工程制药 (2)讲稿

1、关于基因工程制药 (2)第一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月概述20世纪70年代，DNA重组技术诞生，医药领域1982年，人胰岛素问世国内，1989年，干扰素批准上市；1992年，乙肝疫苗 大量生产，应用临床，深入研究， 扩大应用，改造不足 基因工程技术：目的基因插入载体，转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术第二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月基因工程菌定义：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体种类：原核细胞（大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、链霉菌） 真核

2、细胞（酵母、丝状菌、哺乳动 物细胞）第三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月一、基因工程制药微生物表达系统第四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月1.1 大肠杆菌（Eschericlia coli ）G-，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜，裂殖。菌落：白色至黄白色，光滑，直径2-3mm生化与遗传特性 能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒1、大肠杆菌表达系统第五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月质粒载体复制起始点多克隆位点选择标记第六张，PPT共

3、六十七页，创作于2022年6月1.2 质粒类型严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101。松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。表达质粒：能表达基因产物。第七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月1.3 产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。第八张，

4、PPT共六十七页，创作于2022年6月1.4 优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70%），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。第九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月1.5 应用多肽类（甲状旁腺激素（1-34）、利尿钠肽）。激素：胰岛素及2种突变体、抗生素细胞因子类：干扰素、，白介素-2、-11、-1拮抗剂溶栓酶类：rPA 白喉毒素-IL2、融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。第十张，PPT共六十

5、七页，创作于2022年6月2.1 形态特征单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。2、酵母表达系统第十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.2 生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体结合子或营养细胞，进行芽殖。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体。1996年完成其基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF,编码约6000个基因第十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.3 优点与不足五种类型安全、无毒。营养缺陷选择外来

6、质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。第十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.4 应用1981年，Hitzman等：酵母表达人干扰素激素类：人胰岛素及突变体，尿酸水解酶和水蛭素细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素乙肝疫苗等第十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月小结表达系统：宿主菌+表达质粒大肠杆菌系统酵母系统第十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月思考题（1）分析比较基因工程大肠杆菌和

7、酵母表达系统制药的优缺点，如何选择应用？（2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药物？第十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月二、基因工程制药基本环节1、基因工程技术基本流程2、工具酶及表达载体构建3、工程菌的建立4、重组蛋白的分离纯化与分析鉴定第十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月目标基因克隆表达载体构建工程菌PCR，文库，化学合成酶切，连接外源基因导入与培养遗传转化与筛选1、基因工程技术基本流程第十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2、工具酶及表达载体构建2.1工具酶(1)限制性核酸内切酶 回文序列 EcoR 粘性末端：G AATTC CTTAA G 平末端 : G

8、CC GGC CGG CCG第十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月(2) DNA连接酶(3) 聚合酶 DNA聚合酶，RNA聚合酶， 反转录酶G-OHCCTAG-P3535P-GATCCOH-GDNA连接酶，Mg2+GGATCCCCTAGG3535第二十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.2表达载体的设计表达载体：在质粒载体的基础上，在多克隆位点插入外源基因表达盒所构成的载体。外源基因表达盒（调控元件）启动子核糖体结合位点终止子第二十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月2.3目标基因PCR定位克隆(1)PCR技术 PCR (Polymerase chain react

9、ion)：由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进行的复制反应。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因第二十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月PCR扩增的反应体系模板DNA：目标序列，100-10 000 bp引物：两条寡核苷酸，21-27 bp脱氧核苷酸：4和dNTP, 即dATP，dCTP，dGTP,dTTP DNA聚合酶：Taq聚合酶，耐高温缓冲液：KCl、Tris-HCl，MgCl2第二十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月PCR反应原理与过程95,变性56,退火72,延伸完成一个循环第二十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月PCR扩增产物电泳：目标基因

10、片段大小，特异性第二十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（2）酶切反应在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶。反应条件：适宜温度（37）,1小时以上终止反应：加热；加入EDTA,螯合镁离子。电泳检查，酶切完全性第二十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（3）连接反应DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基因共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶连接反应：16-26，数小时，或过夜。终止反应：在70加热10min。第二十七张，PPT共六十七页，创作于

11、2022年6月（4）重组DNA导入宿主细胞原核生物，真核生物转化 转染 显微注射 电穿孔转化：某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象。转染：除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。第二十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月大肠杆菌转化CaCl2法感受态细胞：细菌处于容易接受外源DNA的状态 CaCl2低渗处理；复合物粘附；42，通透性增加，进入细胞重组DNA导入酵母电转化法 感受态细胞（山梨醇） 电转仪 2000V化学转化法 氯化锂或乙酸锂处理，DMSO, 热休克 重组DNA导入哺乳动物细胞显微注射法 显微镜 玻璃毛细血管化学

12、法 DNA-磷酸钙,DEAE葡聚糖 第二十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（5）筛选与鉴定 转化后的细胞类型非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞。转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的）第三十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月筛选方法抗生素筛选法 抗生素的抗性基因，如氨苄青霉素蓝白斑筛选法 基因，重组子白色，非重组子蓝色噬菌斑筛选法 转化子被裂解形成噬菌斑，非转化子正常生长第三十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月蓝白斑筛选- 半乳糖苷酶缺陷菌株，缺失-肽段

13、，无生物活性载体：编码-肽段 转入后互补，具酶活性，分解底物X-gal 蓝色 外源DNA插入-肽段，失活不能分解 白色第三十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月鉴定方法菌落PCR：含有目标基因载体大小：电泳检测酶切鉴定：目标基因插入及插入方向测序确证：目标基因的序列准确无误，阅读框架通读第三十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月3、工程菌的建立过程 适宜宿主菌的转化 筛选鉴定，遗传稳定性目标获得质粒能稳定遗传，基因能高效和定向表达的载体，确保药物的活性第三十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月表达产物的筛选与产物鉴定不同菌种的筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式

14、和存在场所的鉴定，表达部位 包涵体，可溶性蛋白；胞外，周质，胞内表达产物结构活性鉴定 SDS,等电电泳 免疫杂交，末端测序，质谱分析，分析与目标产物的同一性第三十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月4、基因工程药物(重组蛋白)的分离与纯化基因工程的下游处理阶段目的产物在初始原料中的含量较低，组分复杂，稳定性差，容易变性；种类繁多分离纯化需要考虑： 上游阶段，表达系统不同，产物表达形式第三十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第三十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第三十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第三十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月第四十

15、张，PPT共六十七页，创作于2022年6月蛋白质的鉴定纯度鉴定 电泳法： SDS, IEF 化学法： N-端测定，C-端测定 仪器法：HPLC, 质谱，氨基酸组成分析分子量测定 SDS 凝胶过滤 氨基酸组成分析 毛细管电泳第四十一张，PPT共六十七页，创作于2022年6月等电点测定 等电聚焦电泳活性测定 激酶：标记ATP 磷酸化酶： 氧化还原酶 ELISA第四十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月小结基因工程中的工具酶表达载体的构建（目标基因克隆，酶切，连接，转化，筛选）工程菌的建立及重组蛋白的分离与纯化第四十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月思考题工程菌构建的基本过程？所涉

16、及的基本原理是什么？基因工程药物（重组蛋白）的分离纯化方法有哪些？第四十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月三、 基因工程菌培养1、基因工程菌的稳定性2、基因工程菌的培养方式第四十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月（1）基因工程菌的遗传不稳定性的表现：1、基因工程菌的稳定性重组质粒的不稳定性结构不稳定性：重组DNA分子缺失、重排、修饰表观生物学丧失分配不稳定性：重组DNA分子从受体细胞逃逸第四十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配受体细

17、胞中内源的转座元件促进重组分子的缺失重排（2）基因工程菌的遗传不稳定性的产生机制：第四十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月遗传特性（3）影响基因工程菌稳定性的因素：发酵工艺载体的选择宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上培养基比生长速率限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达第四十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月选择剂维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。宿主菌为了保证质粒的稳定性，不丢失。根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。种类：营养缺陷互补和抗生素抗性工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、等抗生素作为选择剂工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨

18、酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。第四十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月诱导物诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。诱导物成为产物表达必不可少的。Lac启动子表达系统：IPTG诱导。甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。第五十张，PPT共六十七页，创作于2022年6月培养基组成对质粒稳定性的影响大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定。对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性。培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。第五十一张，PPT共六十七

19、页，创作于2022年6月比生长速率每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响，提高比生长速率有助于提高质粒稳定性 与培养环境有关；温度和pH一定，限制性基质浓度是主要因素第五十二张，PPT共六十七页，创作于2022年6月限制性基质一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响第五十三张，PPT共六十七页，创作于2022年6月温度大肠杆菌和酿酒酵母生长的最低温度为10大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45酵母生长最适温度为30，最高温度为40生长与

20、生产温度不一致较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性蛋白对于热敏感的蛋白质，易降解。第五十四张，PPT共六十七页，创作于2022年6月pH值细菌：大肠杆菌适宜pH为6.5-7.5真菌：酵母适宜pH为5.0-6.0影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同干扰素在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解，酸性条件下有利于发酵菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达pH值控制：根据实验结果确定生长最适pH,分阶段控制。第五十五张，PPT共六十七页，创作于2022年6月溶解氧工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）两个方面考虑

21、，使之需氧不超过设备考虑溶氧对质粒稳定性的影响调节搅拌转速和通气量第五十六张，PPT共六十七页，创作于2022年6月改进载体受体系统选择性的标记基因引入到表达型载体中 R1质粒 parB正确设置载体上的多克隆位点 禁止DNA片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上 条件致死性相应的受体系统 ssb基因（4）提高基因工程菌稳定性的策略：第五十七张，PPT共六十七页，创作于2022年6月施加选择压力抗药性标记，培养系统中添加相应抗生素 食品和药品生产禁止使用抗生素营养缺陷型标记，培养系统中添加相应营养成分 营养成分复杂，成本较高第五十八张，PPT共六十七页，创作于2022年6月分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 菌体生长阶段外源基因阻遏阶段；获得需要的菌体密度诱导外源基因表达 多级培养： 生长维持菌体稳定性；表达 第五十九张，PPT共六十七页，创作于2022年6月控制目的基因的过量表达使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺环境参数：培养基组分 温度 pH值 溶解氧浓度间隙改变培养条件改变比生长