测序技术的发展以及在生物学中的应用

1、测序技术原理及应用汇报人：胡安中11/25核酸常识与PCR一代测序-sanger二代测序-焦磷酸法单分子测序-瀚海基因测序技术应用22/25核酸（DNA或RNA）核酸酶水解核苷酸 碱基 核糖（脱氧核糖） 磷酸酸水解或酶水解碱基(base)：主要指腺嘌呤（adenine，A）和鸟嘌呤（ guanine, G），胞嘧啶（ cytosine, C）胸腺嘧啶（thymine，T）和尿嘧啶（ uracil, U）一、核酸常识-核酸组成33/25一、核酸常识-核酸结构4DNA结构4/25一、核酸常识-PCR模板、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs和Mg2+PCR原理视频原理55/25二、Sanger测

2、序技术双脱氧末端终止法测序 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核酸次序方法。是由英国剑桥分子生物学试验室生物化学家Sanger等人于1977年创造。关键技术：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳能够区分长度只差一个核苷酸DNA分子；2、利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP特征，使ddNTP参入到寡核苷酸链3-末端。因为ddNTP3不是-OH，不能与下一个核苷酸酶聚合延伸，从而终止DNA链增加。常规PCR测序PCR上机测序与分析66/25什么是双脱氧核糖核苷酸ddNTP？Sanger测序技术双脱氧末端终止法测序77/25Sanger测序技术双脱氧末端终止法测序88/25测序pcr反应体系dd

3、NTPs，dNTPs，Buffer，DNA聚合酶，Template，1 PrimerSanger测序技术双脱氧末端终止法测序视频原理99/25Sanger测序技术双脱氧末端终止法测序视频原理1010/25三、高通量测序高通量测序技术（High-throughputtsequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencingtechnology），能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。主 要 指 以Roche/454 焦磷酸测序、 Illumina/Solexa 聚合酶合成测序和 ABI/SOLiD 连接酶测序，为代表测序技术 。人类全基

4、因组约30亿个DNA碱基对（1）；所以使用一代测序对人类基因组进行全基因组测序在速度慢与测序成本高都急需突破。（1）、Science（）291：1304-1351人基因组总共3G。普通做全基因组测序需要30-40 x覆盖度（确保一定测序质量），所以测序一次全基因组得到数据量将有90-120G。1111/25 焦磷酸测序技术是由4种酶催化同一反应体系中酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶协同作用下

5、，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，经过检测荧光释放和强度，到达实时测定DNA序列目标。焦磷酸测序技术反应体系：反应底物、待测单链、测序引物和4种酶组成。反应底物：5-磷酰硫酸(adenosine-5-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。三、高通量测序焦磷酸测序原理1212/25三、高通量测序焦磷酸测序步骤1、待测DNA文库构建 将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后续扩增测序接头A和一段含有生物素接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素磁珠结合，其中片段AA被洗

6、脱掉，片段AB/BA/BB结合到磁珠上，经过变性处理回收含有接头A和接头B单链DNA。2、Emulsion PCR（乳液PCR）将这些ssDNA分别单独与水油包被直径大约28um磁珠在一起孵育、退火，因为磁珠表面含有与接头互补寡聚核苷酸序列，所以ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以能够确保每一个磁珠结合小片段都会在各自孵育体系内独立扩增，扩增产物任能够结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而到达下一步测序反应所需模板量。1313/25三、高通量测序焦磷酸测序原理3、测序将携带DNA磁珠

7、与其它反应物混合物，放入PTP板中进行测序。PTP板上含有很多直径约为44um小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，经过这种方法固定每个磁珠位置以监测接下来测序反应测序开始时，放置在四个单独试剂瓶里四种碱基，依照T、A、C、G次序依次循环进入PTP平板，每次只进一个碱基。假如发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸，这个焦磷酸在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酶4种酶协同作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出光信号实时被仪器配置高灵敏度CCD捕捉到。统计并分析这些 荧光信号，就能够取得高质量DNA序列。（2）（2）高通量

8、基因测序图像处理与数据分析_叶丙刚（B）焦磷酸测序1414/25三、高通量测序焦磷酸测序原理GATC视频原理1515/25四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术三代基因测序仪研发，首先要突破 三大关键技术难点全内反射荧光显微技术虚拟终止碱基单分子碱基识别16图a图a Single molecule targeted sequencing for cancer gene mutation detection 16/25单分子荧光成像技术 单分子荧光测序采取高灵敏度宽视野全内反射荧光（TIRF）显微成像技术，可直接观察到极微弱碱基单分子荧光信号。经过精心设计TIRF照明系统在芯片表面产生倏

9、逝波，仅允许芯片表面200nm深度以内荧光分子被激发，消除了光路中绝大多数背景噪声，因而能取得极佳信噪比以识别出单个碱基信号，200nm深度，理论最高读长为600个碱基单分子全内反射显微成像技术TIRF四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术1717/25四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术单分子全内反射显微成像技术TIRF18图b Single molecule targeted sequencing for cancer gene mutation detection 图b18/25虚拟终止碱基四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术19瀚海基因“虚拟终止碱基”技术为

10、合成测序过程提供更高保真度和反应效率。这种类碱基在单个位置同时连接了终止结构和荧光标识，含有愈加靠近天然酶反应活性位点。经过可准确单步控制碱基延伸、合成终止、荧光激发过程之后，仅需一步切除，即可去除碱基修饰，允许下一轮延伸和测序单分子碱基识别DirectCall是专门为单分子荧光测序定制碱基识别算法，能够准确检测、定位、配准和识别单个碱基信号。DirectCall不但防止了传统二代测序中相位不一致和GC偏好顽疾，而且在现有单分子测序领域可实现当前最高测序准确率。19/25四、单分子测序-瀚海基因三代单分子靶向测序技术单分子靶向测序流程20图c Single molecule targeted

11、sequencing for cancer genemutation detection 图c20/2521单分子荧光测序是怎样工作？21/2522测序方法/平台企业/企业网站方法/酶测序长度运行时间正确率（%）成本（美元/GB）第一代测序技术Sanger/ABI3730 DNA AnalyzerApplied BiosystemsSanger法/DNA聚合酶1000bp2h99.999（1）1400000高通量测序技术454/GS FLXTitanium SeriesRoche焦磷酸测序法/DNA聚合酶400bp10h99.5（2）9000单分子测序技术GenoCare瀚海基因/边合成边测序

12、/DNA聚合酶600bp/99.9985100美元/基因组1、Liu L, Li YH, Li SL, Hu N, He YM, Pong R, Lin DN, Lu LH, Law M. Comparison of next-generation sequencing systems. J Biomed Biotechnol, , : Article ID251364. 2、Gilles A, Meglcz E, Pech N, Ferreira S, Malausa T, Martin JF. Accuracy and quality assessment of 454 GS-FLX Ti

13、tanium pyrosequencing. BMC Genom, , 12(1): 245. 22/25生育健康-产前基因检测胎儿染色体异常无创产前基因检测孕前基因检测孕前染色体检测胚胎植入前染色体异常检测胚胎植入前单基因遗传病检测病原微生物病原微生物快速检测人乳头状瘤病毒基因检测乙肝耐药/分型检测丙肝分型检测肿瘤分子筛查遗传性肿瘤基因检测遗传性乳腺癌基因检测肿瘤个体化诊疗基因检测肺癌个体化诊疗基因检测乳腺癌个体化诊疗基因检测五、测序技术应用人类健康科研辅助SNP位点检验寻找致病基因、诊疗及预测致病风险、药品基因体学及新药发觉（个性化用药）转录组测序UTR判定、Intron边界判定、Start codon判定、可变剪切研究等；miRNA测序-miRNA是调控基因表示一个普遍方式23遗传病筛查与诊疗苯丙酮尿症先天性甲状腺功效低下症葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(俗称蚕豆病)先天性肾上腺皮质增生症23/25GIF1基因 控制水稻灌浆和产量Ertao Wang et al. Nature Genetics，（11）,40,1370-1374 Control of rice grain-filling and yield by a gene with a potentialNature Biotechnology , ,23 (4) :482-7 Improving the nutrit