食品毒理学实验管理知识

1、第一章 食品品毒理学学实验基基础以科学研研究为目目的而进进行科学学饲养繁繁殖的动动物称为为实验动动物。实实验动物物学作为为在现代代科学带带动崛起起的一门门以生命命科学为为主体，以医学学、生物物为核心心的综合合性独立立的新兴兴学科，正以崭崭新的面面貌，异异乎寻常常的速度度，影响响着整个个生命科科学各领领域，成成为生命命科学研研究的奠奠基学科科和重要要支撑条条件，因因而受到到世界各各国政府府和科学学家的重重视，甚甚至作为为衡量一一个国家家生物科科学水平平高低的的标志之之一。食品毒理理学的很很多研究究工作需需要通过过动物实实验来进进行。使使用实验验动物进进行科研研的优点点是花费费人力、物力较较少，时

2、时间短，易发现现单因素素与结果果的关系系，能提提供大量量有价值值的可与与人类生生命活动动现象相相类比的的资料。在毒理理学实验验研究中中，健康康的实验验动物是是保证工工作顺利利进行和和获得正正确可靠靠的研究究结果的的重要条条件。食品毒理理学研究究外源化化学物对对于机体体(特别是是人体)的有害害作用及及其机制制。食品品毒理学学研究的的主要手手段是动动物实验验。体内内试验是是以实验验动物为为模型，最终目目的是通通过外源源化学物物对实验验动物的的毒性反反应，向向人(原型)外推，以期评评估外源源化学物物对人的的危害及及危险性性。体外外实验主主要用于于筛选和和预测急急性毒性性和机制制研究；人体实实验和流流

3、行病学学调查则则可进一一步深化化和证实实在动物物实验中中所得到到的资料料。实际际上，食食品毒理理学作为为一门实实验科学学是以动动物实验验为中心心的，食食品毒理理学动物物实验的的设计、实施、结果观观察和评评价是毒毒理学研研究的基基本方法法。食品毒理理学试验验是对化化学物安安全性评评价的主主要手段段，已为为各国际际组织或或各国的的行政部部门所颁颁布的规规程或指指南列为为常规试试验，有有称为法法规毒理理学试验验(reegullatoory toxxicoo1oggy ttestt)，这这类毒理理学试验验是以筛筛查和描描述外来来化学物物的毒性性为目的的，属于于描述毒毒理学范范畴。食品毒理理学实验验的原

4、则则和局限限性一、食品品毒理学学实验的的原则在毒理学学的试验验中，有有三个基基本的原原则。第一个原原则，化化学物在在实验动动物产生生的作用用，可以以外推于于人。基基本假设设为：人是最最敏感的的动物物物种；人和实实验动物物的生物物学过程程包括化化学物的的代谢，与体重重(或体表表面积)相关。这两个个假设也也是全部部实验生生物学和和医学的的前提。以单位位体表面面积计算算在人产产生毒作作用的剂剂量和实实验动物物通常相相近似。而以体体重计算算则人通通常比实实验动物物敏感，差别可可能达110倍。因此可可以利用用安全系系数来计计算人的的相对安安全剂量量。已知知人致癌癌物都对对某种实实验动物物具有致致癌性；实

5、验动动物致癌癌物是否否都对人人有致癌癌性，还还不清楚楚，但这这已作为为动物致致癌试验验的基础础。一般般认为，如果某某一化学学物对几几个物种种实验动动物的毒毒性是相相同的，则人的的反应也也可能是是相似的的。第二个原原则是实实验动物物必须暴暴露于高高剂量，这是发发现对人人潜在危危害的必必需的和和可靠的的方法。此原则则是根据据质反应应的概念念，随剂剂量或暴暴露增加加，群体体中效应应发生率率增加。毒理学学试验中中，一般般要设33个或3个以上上剂量组组，以观观察剂量量-反应(效应)关系，确定受受试化学学物引起起毒效应应及其毒毒性参数数。毒性性试验的的设计并并不是为为了证明明化学品品的安全全性，而而是为了

6、了表征化化学品可可能产生生的毒作作用。仅仅仅检测测受试化化学物在在人的暴暴露剂量量是否引引起毒效效应是不不够的。当引起起毒效应应的最低低剂量(LOAAEL)与人的的暴露剂剂量接近近时，说说明该化化学物不不安全。当该剂剂量与人人的暴露露剂量有有很大的的距离(几十倍倍，几百百倍或以以上)，才认认为具有有一定安安全性，此距离离越大，安全性性越可靠靠。如果果在研究究中所用用的一系系列的剂剂量不能能引起毒毒性效应应，则认认为所用用剂量还还不足够够高，应应增加剂剂量，以以确定受受试化学学品的毒毒性。但但如果在在试验的的最高剂剂量组的的剂量与与人可能能的暴露露剂量有有足够的的安全界界限，则则对于安安全性评评

7、价来说说未观察察到毒效效应的研研究是可可以接受受的。在在毒理学学试验中中实验模模型所需需的动物物总是远远少于处处于危险险中的人人群。为为了在少少量动物物得到有有统计学学意义的的可靠的的结果，需要应应用相对对较高的的剂量，以使效效应发生生的频率率足以检检测。例例如，低低达0.01的的癌症发发生率，这意味味着在1100万万人群中中有1000人发发生癌症症，此发发生率太太高，不不能为公公众接受受。在实实验动物物直接检检测如此此低发生生率将至至少需要要300000只只动物。因此，别无选选择，在在毒理学学试验中中，对相相对较少少的实验验动物必必须以较较高剂量量进行试试验，然然后根据据毒理学学原则外外推估

8、计计低剂量量暴露的的危险性性。第三个原原则，成成年的健健康(雄性和和雌性未未孕)实验动动物和人人可能的的暴露途途径是基基本的选选择。选选用成年年的健康康(雄性和和雌性未未孕)实验动动物是为为了使实实验结果果具有代代表性和和可重复复性。以以成年的的健康(雄性和和雌性未未孕)实验动动物作为为一般人人群的代代表性实实验模型型，而将将幼年和和老年动动物、妊妊娠的雌雌性动物物、疾病病状态作作为特殊殊情况另另作研究究。这样样可降低低实验对对象的多多样性，减少实实验误差差。毒理理学实验验结果的的敏感性性取决于于受试物物处理引引起毒效效应强度度和实验验误差两两个因素素，处理理引起的的毒效应应强，实实验误差差小

9、，则则实验结结果的敏敏感性增增加，反反映受试试物处理理的真实实效应，反之亦亦然。在在下文所所述的实实验设计计是要规规定实验验条件，严格控控制可能能影响毒毒效应的的各种因因素，实实施质量量保证，降低实实验误差差。只有有这样，才能保保证试验验结果的的准确性性和可重重复性，不能重重复的实实验结果果是没有有任何科科学价值值的。外外源化学学物以不不同途径径染毒，实验动动物表现现的毒性性可有很很大差异异，这是是由于因因染毒部部位解剖剖生理特特点不同同，外源源化学物物吸收进进入血液液的速度度和量也也不同，首先到到达的器器官和组组织也不不同。因因此，毒毒理学试试验中染染毒途径径的选择择，应尽尽可能模模拟人接接

10、触该受受试物的的方式。二、食品品毒理学学实验的的局限性性历史上，环境污污染物及及某些药药物所引引起的中中毒和死死亡多次次发生，引起各各国的重重视，推推动了毒毒理学的的发展，各国政政府主管管部门制制订和多多次修订订了有关关药品和和各种化化学品安安全性评评价的规规范或准准则，希希望在啮啮齿类和和非啮齿齿类的毒毒理学研研究能为为有关候候选新药药和各种种化学品品提供安安全性证证据，但但以动物物的资料料预测人人的毒性性的预测测价值尚尚有待于于研究。Lummleyy(19990)和Igarrashhi(119944)根据据有限的的临床资资料报告告，发现现对人的的毒性约约一半不不能由临临床前(动物)毒性研研

11、究预测测。Heeywoood(19883)报报告277个化学学物(大多为为药品)的靶器器官毒性性在大鼠鼠和狗(或猴)之间的的相符率率仅200。OOlsoon等(19998)报告1331种化化学物对对动物的的毒性与与人的毒毒性相符符率，啮啮齿类为为6，非非啮齿类类(狗和猴猴)为28，合并达达36，所有的的物种相相符率可可达699。按按照目前前的规范范，进行行毒理学学安全性性评价，可以在在一定程程度上提提高新药药和各种种化学品品的使用用安全性性，但仍仍不能完完全排除除对人健健康危害害的风险险。WHHO在临床前前药物安安全性实实验原则则的文文件中指指出“虽然事事先对生生物活性性物质进进行了最最仔细彻

12、彻底的研研究，但但给人使使用时总总是不可可避免地地要冒一一定的风风险。”这就是是利用动动物实验验的局限限性，即即动物实实验的结结果外推推到人的的不确定定性。用实验动动物的毒毒理学实实验资料料外推到到人群接接触的安安全性时时，会有有很大的的不确定定性。这这是因为为，外源源化学物物的毒性性作用受受到许多多因素的的影响。首先，实实验动物物和人对对外源化化学物的的反应敏敏感性不不同，有有时甚至至存在着着质的差差别。虽虽然在毒毒理学实实验中通通过用两两种或两两种以上上的动物物，并尽尽可能选选择与人人对毒物物反应相相似的动动物，但但要完全全避免物物种差异异是不可可能的。而且，实验动动物不能能述说涉涉及主观

13、观感觉的的毒效应应，如疼疼痛、腹腹胀、疲疲乏、头头晕、眼眼花、耳耳鸣等，这些毒毒效应就就难以或或不可能能发现。在动物物实验中中，可观观察到体体征(ssignn)，而而没有症症状(ssympptomm)。第二，在在毒理学学实验中中，为了了寻求毒毒作用的的靶器官官，并能能在相对对少量的的动物上上就能得得到剂量量-反应或或剂量-效应关关系，往往往选用用较大的的染毒剂剂量，这这一剂量量通常要要比人实实际接触触的剂量量大得多多。有些些化学物物在高剂剂量和低低剂量的的毒性作作用规律律并不一一定一致致，如大大剂量下下出现的的反应有有可能是是由于化化学物在在体内超超过了机机体的代代谢能力力，这就就存在高高剂量

14、向向低剂量量外推的的不确定定性。第三，毒毒理学实实验所用用动物数数量有限限，那些些发生率率很低的的毒性反反应，在在少量动动物中难难以发现现。而化化学物一一旦进入入市场，接触人人群往往往会很大大。这就就存在小小数量实实验动物物到大量量人群外外推的不不确定性性。第四，实实验动物物一般都都是实验验室培育育的品系系，一般般选用成成年健康康动物，反应较较单一，而接触触人群可可以是不不同的人人种、种种族，而而且包括括年老体体弱及患患病的个个体，在在对外源源化学物物毒性反反应的易易感性上上存在很很大差异异。以上这些些都构成成了从毒毒理学动动物实验验结果向向人群安安全性评评价外推推时的不不确定因因素。毒理学毒

15、毒性评价价试验的的基本目目的毒理学实实验的常常规部分分是毒性性评价或或安全性性评价试试验。为为了对受受试物的的毒性进进行全面面的测试试，增强强测试结结果的可可靠性，权威机机构规定定了评价价程序，以保证证毒性评评价研究究可以达达到普遍遍能接受受的最低低要求和和原则。毒理学学家认为为毒理学学试验程程序应该该有一定定的灵活活性。对对毒理学学试验的的原理和和设计思思路的深深入理解解，有助助于研究究者对评评价程序序的实施施，在发发现新的的现象或或线索时时，可进进行一些些补充实实验来证证实，并并可进一一步研究究其机制制。毒性评价价或安全全性评价价方面的的基本目目的包括括以下几几点： 1. 受试物物毒作用用

16、的表现现和性质质。在急急性和慢慢性毒性性试验中中，观察察受试物物对机体体的有害害作用，对有害害作用的的观察应应该是对对每个实实验动物物进行全全面的逐逐项的观观察和记记录。发发现有害害作用是是进行剂剂量-反应(效应)研究的的前提。 2. 剂量-反应(效应)研究。剂量-反应(效应)研究是是毒性评评价和安安全性评评价的基基础。通通过对不不同有害害作用的的剂量-反应(效应)研究，可以得得到该受受试物的的多种毒毒性参数数。在急急性(致死性性)毒性试试验中，应该得得到LDD50，也也可以得得到LDD01和MTDD。在急急性非致致死性毒毒性试验验中，应应该得到到急性可可观察到到有害作作用的最最低剂量量(LO

17、OAELL)和未未观察到到有害作作用的剂剂量(NNOAEEL)。在亚急急性、亚亚慢性及及慢性毒毒性试验验中，应应该得到到相应的的LOAAEL和和NOAAEL。在致突突变、致致癌和致致畸等特特殊毒性性试验中中，剂量量-反应(效应)研究将将为确定定受试物物是否具具有这些些特殊毒毒性提供供依据。在致畸畸试验也也可得到到LOAAEL和和NOAAEL；在致突突变、致致癌试验验中，尽尽管认为为是无阈阈值的，但也可可得到表表观的LLOAEEL和NOAAEL。3. 确确定毒作作用的靶靶器官。确定受受试物有有害作用用的靶器器官，是是毒理学学研究的的重要目目的，以以阐明受受试物毒毒作用的的特点，并为进进一步的的机

18、制研研究和毒毒性防治治提供线线索。4. 确确定损害害的可逆逆性。一一旦确认认有害作作用存在在，就应应研究停停止接触触后该损损害是否否可逆和和消失，器官和和组织功功能是否否能恢复复，还是是像化学学致癌作作用那样样停止接接触后损损害继续续发展? 毒性性的可逆逆性关系系到对人人的危害害评价，如果受受损的器器官组织织能够修修复并恢恢复正常常功能，则可能能接受较较高危险险性的接接触水平平。当然，毒毒理学研研究还可可能有其其他的目目的和要要求，例例如毒作作用的敏敏感检测测指标和和生物学学标志、毒作用用机制研研究、受受试物的的毒物动动力学和和代谢研研究、中中毒的解解救措施施等。对对这些要要求，应应扩展常常规

19、试验验的设计计以包括括有关的的项目，或者另另外设计计和进行行靶器官官毒理学学研究及及机制毒毒理学研研究。实验动物物的选择择和处理理毒理学的的动物实实验是以以实验动动物作为为研究对对象的，为获得得可靠的的研究结结果，先先决条件件是正确确地选用用实验动动物。一、实验验动物物物种的选选择外源化学学物的固固有毒性性往往在在人和不不同物种种实验动动物之间间表现不不同，物物种差别别可以表表现在量量方面，引起毒毒性的剂剂量差别别，即毒毒性大小小的差别别，如有有报道，对人1138种种化学物物的敏感感性为大大鼠的11.810.5倍。物种差差别也可可以表现现在质方方面(毒性效效应的差差别)，如除除草剂百百草枯(对

20、草快快)对人引引起肺损损伤，而而对狗则则未见到到。因此此，需要要对实验验动物物物种进行行选择。物种间间毒性反反应差别别的原因因，可能能归纳为为解剖与与生理学学差异，遗传与与代谢的的差异等等。对实验动动物物种种选择的的基本原原则是：选择对对受试物物在代谢谢、生物物化学和和毒理学学特征与与人最接接近的物物种；自自然寿命命不太长长的物种种；易于于饲养和和实验操操作的物物种；经经济并易易于获得得的物种种。在选择实实验动物物时存在在固有的的限制。可利用用的物种种不多，主要原原因包括括经济(购买和和饲养的的费用)、实验验动物的的寿命、行为和和生活能能力、处处置，也也许最重重要的是是对该物物种“正常”生理和

21、和病理的的资料，以及对对所研究究的毒性性的敏感感性。要要利用对对受试物物在代谢谢、生物物化学和和毒理学学特征与与人最接接近的物物种，这这就需要要了解实实验动物物物种和和人对受受试化学学物的吸吸收、生生物转化化等资料料，但这这往往并并不切合合实际，因为首首先需要要进行一一系列的的比较研研究，而而对人体体的资料料在动物物试验之之前是很很难得到到的。在毒理学学研究中中常用的的实验动动物物种种如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗狗。其他他可能用用到的实实验动物物有地鼠鼠、猕猴猴、小型型猪、鸡鸡等。其其中，大大鼠、小小鼠、豚豚鼠和地地鼠为啮啮齿目动动物。常常用实验验动物生生物学和和生理学学参数见见表5-1。以

22、上所述述毒理学学实验常常用的实实验动物物各物种种中，实实际上没没有一种种完全符符合上述述物种选选择的原原则，目目前常规规选择物物种的方方式是利利用两个个物种，一种是是啮齿类类，另一一种是非非啮齿类类。系统统毒性研研究最常常用的啮啮齿类是是大鼠和和小鼠，非啮齿齿类是狗狗。豚鼠鼠常用于于皮肤刺刺激试验验和致敏敏试验，兔常用用于皮肤肤刺激试试验和眼眼刺激试试验。遗遗传毒理理学试验验多用小小鼠，致致癌试验验常用大大鼠和小小鼠，致致畸试验验常用大大鼠、小小鼠和兔兔。迟发发性神经经毒性试试验常用用母鸡。一般假假设，如如以与人人相同的的接触方方式、大大致相同同的剂量量水平，在两个个物种有有毒性反反应，则则人

23、有可可能以相相同的方方式发生生毒性反反应。当当不同物物种的毒毒性反应应有很大大的差异异时，必必须研究究外源化化学物在在不同物物种的代代谢、动动力学及及毒作用用机制，然后才才可将实实验结果果外推到到人。表5-11 常常用实验验动物生生物学和和生理学学参数参 数数猴狗猫兔大鼠小鼠豚鼠地鼠成体体重重(kg)3.514.003.33.70.4550.03350.4330.122寿命(aa)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530饲料消耗耗 (成本本g/dd)1504001001801051210成体代谢谢(calkgd)1588080110130600100

24、250体温()38.8838.9938.6639l4438l2237.4438.6638.00呼吸频率率50202553851609083(次mmin)(4060)(1030)(2030)(4065)(651100)(802400)(701000)(351300)心率(次次minn)200100120200328600300450血压mmmHg15912771481000155100011080130/901207577/550108/77(收缩舒张)出生体重重(g)500700011000220001251005-61.57511002.0断乳时体体重(gg)4400058000300001

25、0015000405501011225035开眼(dd)出生当天天81228122101011211出生当天天15妊娠(dd)16863633121206716性周期(d)282215228151164545161194动情期(d)1271339199301111窝数量136161133691122151122断乳年龄龄(周)162246698343234生殖年龄龄(月)549106723232生殖期(年)1011551004131131生殖季节节任何时间间春，秋冬季23个月任何时间间任何时间间任何时间间任何时间间任何时间间所需面积积(tff2)*68330.40.40.70.344环境温度度

26、()1822818228182281822819225192251922519225血容量( MLL/Kgg)7579605365807585凝血时间间(s)90180120300601460143HCT(红细胞胞)4245404246414250Hb(ggbl)12.5516.0011.8813.6614.8816.0012.4412.00*所需面面积(fft2)，及为英英尺，1ftt30.48ccm引自：参考书书7，P133二、实验验动物品品系的选选择品系(sstraain)是实验验动物学学的专用用名词，指用计计划交配配的方法法，获得得起源于于共同祖祖先的一一群动物物。实验动物物按遗传传学

27、控制制分类可可分为：近交系系：指全全同胞兄兄妹或亲亲子之间间连续交交配200代以上上而培育育的纯品品系动物物。如小小鼠有津津白I、津白白、6155，DBAA1和DBAA2，BALLB/CC，C3HH，C577B6J，A和AHe等。杂交群群动物(杂交1代，F11)，指指两个不不同的近近交系之之间有目目的进行行交配，所产生生的第一一代动物物。封闭群群：一个个种群在在五年以以上不从从外部引引进新血血缘，仅仅由同一一品系的的动物在在固定场场所随机机交配繁繁殖的动动物群。如昆明种种小鼠、NIHH小鼠、LACCA小鼠鼠、F3344大大鼠、WWisttar大大鼠、SSD(SSpraaguee-Daaulee

28、y)大大鼠等。根据实验验动物遗遗传的均均一性排排序，近近交系最最高、杂杂交群次次之、封封闭群较较低。不不同品系系实验动动物对外外源化学学物毒性性反应有有差别，所以毒毒理学研研究要选选择适宜宜的品系系，对某某种外源源化学物物毒理学学系列研研究中应应固定使使用同一一品系动动物，以以求研究究结果的的稳定性性。遗传毒理理学一般般利用啮啮齿类动动物，主主要是小小鼠或大大鼠。如如果有合合适的理理由，其其他物种种也可接接受。有有的文献献报告在在小鼠骨骨髓微核核试验MMSAe品系系比dddy，CD-1或BDFF品系更更敏感。但一般般认为还还没能证证明某一一品系对对所有的的遗传毒毒性物质质比其他他品系都都敏感。

29、在致癌癌试验中中对实验验动物的的品系有有一定的的要求，特别重重视有关关病理损损害的自自发发生生率。例例如，某某些大鼠鼠品系垂垂体肿瘤瘤发生率率高，则则不适用用于靶器器官为内内分泌系系统的毒毒性研究究。又如如B6CC3F11雄小鼠鼠肝肿瘤瘤高发生生率可能能有碍于于肝致癌癌反应的的检测。三、对实实验动物物微生物物控制的的选择按微生物物控制分分类，实实验动物物分为四四级，见见表5-2。对对于毒性性试验及及毒理学学研究应应尽可能能使用二二级(或二级级以上)的动物物，以保保证实验验结果的的可靠性性。表5-22 实验动动物微生生物等级级级 别要 求I 级 级 级IV 级级普通动物物，应没没有传染染给人的的

30、疾病清洁动物物，除II级标准准外，种种系清楚楚，没有有该动物物特有的的疾病无特定病病原体动动物(SSPF)，除级标准准外，动动物为剖剖腹产或或子宫切切除产、按纯系系要求繁繁殖，在隔离器器内或层层流室内内饲养，可有不不致病细细菌丛，没有致致病病原原体无菌动物物，在全全封闭无无菌条件件下饲养养的纯系系动物，动物体体外不带带有任何何微生物物和寄生生虫(包括绝绝大部分分病毒)四、个体体选择 实验验动物对对外来化化学物的的毒性反反应还存存在个体体差异，应注意意实验动动物的个个体选择择。1. 性性别同一一物种、同一品品系的实实验动物物雌雄两两性通常常对相同同外源化化学物毒毒性反应应类似但但雌雄两两性对化化

31、学物的的毒性敏敏感性上上存在着着差别。有文献献报道在在1499种外源源化学物物中雌雄雄敏感性性比值小小鼠平均均为0.92，大鼠为为0.888，这这种差别别表现在在实验动动物性发发育成熟熟开始，直至老老年期。可见雌雌雄两性性动物的的性激素素性质和和水平是是关键因因素，一一般讲雄雄性动物物体内微微粒体细细胞色素素P-4450酶酶系活性性大于雌雌性动物物，所以以经该酶酶系降解解解毒的的外源化化学物对对雌性动动物表现现的毒性性大，然然而经该该酶活化化增毒的的外源化化学物却却相反。如果已知知不同性性别的动动物对受受试物敏敏感性不不同，应应选择敏敏感的性性别。如如对性别别差异不不清楚，则应选选用雌雄雄两种

32、性性别。如如实验中中发现存存在性别别差异，则应将将不同性性别动物物的实验验结果分分别统计计分析。在遗传毒毒理学体体内试验验中，对性别别的选择择有几种种意见： (1) 对单单个物种种应用两两种性别别。 (2) 对单单个物种种应用两两种性别别，除非非已在一一个性别别得到阳阳性反应应，就不不必对另另一种性性别进行行试验。 (3) 对单单个物种种应用两两种性别别，除非非经毒代代动力学学研究证证明受试试物(和其代代谢产物物)在雄性性和雌性性无差别别和或或如果在在确定剂剂量的预预试验证证明有相相等毒性性。此假假定在非非遗传毒毒性与遗遗传毒性性之间有有相关。 (4) 对单单个物种种常规用用一种性性别(雄性或

33、或雌性)，除非非预期证明存存在性别别差异。由于历历史的原原因UDDS体内内体外外试验常常规用雄雄性大鼠鼠。一般来说说，对于于初次试试验的受受试物，应该采采用两种种性别。对大鼠鼠和小鼠鼠各一种种性别进进行试验验可能比比单个物物种两种种性别提提供更好好的危害害鉴定，但这需需要更多多的资料料来证明明。 2. 年龄和和体重实实验动物物同人类类一样，生命全全程大体体上可区区分三个个阶段，即幼年年期(从出生生到性成成熟之前前)、成年年期和老老年期。在成年年期，各各种激素素(包括性性激素)、代谢谢酶都处处于高峰峰稳定期期，并对对外源化化学物的的毒性反反应差异异较小，且有代代表性。在幼年年期和老老年期，对外源

34、源化学物物的生物物转运和和生物转转化，靶靶器官和和受体的的敏感性性均与成成年期不不同。如如有报道道外源化化学物对对成年动动物的致致死剂量量(或LD500)与新生生动物比比较，其其比值在在0.000216之间间，表明明有的外外源化学学物对新新生动物物毒性低低，也有有的毒性性反应强强。毒理理学试验验选用实实验动物物的年龄龄取决于于试验的的类型。急性试试验一般般选用成成年动物物;慢性试试验因实实验周期期长，应应选用较较年幼的的或初断断乳的动动物，以以使实验验周期能能复盖成成年期。实验动动物的年年龄应由由其出生生日期来来定，但但实际工工作中常常以动物物的体重重粗略地地判断动动物的年年龄，作作为挑选选适

35、龄动动物的依依据。同同一试验验中，组组内个体体间体重重差异应应小于110，各组间间平均体体重差异异不应超超过5。 3. 生理状状态在毒毒理学试试验中动动物如出出现妊娠娠，则影影响体重重及其他他指标的的检测结结果，并并且，性性激素对对外源化化学物代代谢转化化有影响响，故应应选用未未产未孕孕的雌性性动物。雌雄动动物应分分笼饲养养。但在在某些试试验如显显性致死死试验、致畸试试验及繁繁殖试验验等，则则需有计计划地合合笼交配配。 4. 健康状状况实验验动物的的健康状状态对毒毒理学试试验结果果有很大大的影响响，因此此应选用用健康动动物。对对于实验验动物微微生物控控制的选选择实际际上是选选择健康康状况的的一

36、个重重要指标标，健康康个体的的选择还还包括了了其他方方面。健健康动物物应发育育正常、体形健健壮，无无外观畸畸形，被被毛浓密密、有光光泽、顺顺贴而不不蓬乱，行动灵灵活、反反应敏捷捷，眼睛睛明亮有有神，表表皮无溃溃疡和结结痴，天天然孔道道干净无无分泌物物等。为确保选选择健康康动物，一般在在实验前前观察557天。对对于大鼠鼠和狗的的亚慢性性和慢性性试验，可在实实验前采采血进行行血液学学和血液液生化学学检查，异常的的动物应应剔除；对狗应应常规驱驱除肠道道寄生虫虫。合理的全全营养饲饲料对维维持实验验动物健健康和正正常的生生理活动动是至关关重要的的。高温温与低温温时外源源化学物物的毒性性一般比比常温为为高

37、。气气温升高高而毒性性增大，这种毒毒性变化化可能是是由于温温度影响响了毒物物动力学学所致。高温、高湿环环境共存存时皮肤肤更易于于外源化化学物经经皮肤吸吸收。人工昼夜夜周期，即使动动物处于于人工调调控的112小时时白昼(早6点至晚晚6点)及12小时时黑夜(晚6点至次次日早66点)，以稳稳定其生生物时间间节律。在正常常、健康康的动物物每天224小时时的生理理规律不不尽相同同，即存存在着生生物时间间节律，对外源源化学物物的毒性性反应也也有昼夜夜性时间间变化，因此出出现毒理理学新的的分支学学科，称称为时间间毒理学学(Chhronnotooxiccoloogy)。由于于动物存存在时间间节律，外源化化学物

38、在在不同时时间表现现的毒性性反应有有差别，所以在在毒理学学实际工工作中，尤其是是进行亚亚慢性和和慢性染染毒时，每日的的染毒时时间应固固定一致致，以防防止出现现时间毒毒性的影影响。而而且采取取动物生生物样品品(如血、尿等)进行各各种指标标的化验验或一些些生理功功能的检检查(如血压压、体温温等)也应固固定时间间。根据我国国的法规规和有关关规定，国家实实行实验验动物的的质量监监督和质质量合格格证制度度。实验验动物的的保种、饲育、供应和和应用单单位，由由各级医医学动物物管理委委员会进进行定期期监督、监测，并颁发发实验动动物和实实验设施施的合格格证书(有效期期5年)。应用用的实验验动物必必须有完完整的资

39、资料。进进行动物物实验的的人员应应经培训训，取得得资格认认可(上岗证证)。实验验动物的的饲养设设施、环环境条件件及饲料料等必须须符合有有关的国国家标准准。食品毒理理学试验验设计要要点一、体内内毒理学学试验设设计 1. 剂量分分组在毒毒理学试试验中，最重要要的就是是研究剂剂量-反应(效应)关系，也就是是当外源源化学物物染毒剂剂量增加加，实验验动物的的毒性反反应(效应)随之而而增强。剂量-反应(效应)关系的的存在是是确定外外源化学学物与有有害作用用的因果果关系的的重要依依据，也也可证明明实验结结果的可可靠性。因此，在毒理理学试验验中，一一般至少少要设33个剂量量组(即高剂剂量组、中剂量量组、低低剂

40、量组组)，希望望能得到到满意的的剂量-反应(效应)关系。一般要求求，高剂剂量组应应出现明明确的有有害作用用，或者者高剂量量组剂量量已达到到染毒的的极限剂剂量(如大鼠鼠或小鼠鼠灌胃或或注射的的最大容容量)。低剂剂量组应应不出现现任何可可观察到到的有害害作用(即相当当于NOOAELL)，但但低剂量量组剂量量应当高高于人可可能的接接触剂量量，至少少等于人人可能的的接触剂剂量。中中剂量组组的剂量量介于高高剂量组组和低剂剂量组之之间，应应出现轻轻微的毒毒性效应应(即相当当于LOOAELL)。高高、中、低剂量量组剂量量一般按按等比例例计算，剂量间间距应为为2或，低剂剂量组剂剂量一般般为高剂剂量组剂剂量的1

41、1/101/20。急性毒性性试验分分组和剂剂量选择择见下一一章。亚亚慢性毒毒性试验验的高剂剂量应该该用急性性毒性的的LD500的某个个分数或或LD011。在长长期或致致癌试验验，最高高剂量选选择为由由亚慢性性毒性试试验确定定的最大大耐受剂剂量(MMTD)，毒动动学或代代谢资料料可能有有助于决决定剂量量，特别别是有受受试物或或其代谢谢产物的的蓄积或或有剂量量依赖性性解毒改改变的证证据。有有人认为为，在新新药安全全性评价价中，试试验期限限等于或或小于114天，限度剂剂量为22g(kggd)；如如大于114天限限度剂量量为1gg(kgg、d)。在在无毒性性情况下下，对限限度剂量量的例外外是基于于该途

42、径径的最大大染毒容容量。毒理学试试验常用用的对照照有4种： (1) 未处处理对照照组(以前有有称为空空白对照照组)：即对对照组不不施加任任何处理理因素，不给受受试物也也不给以以相应的的操作。未处理理对照组组往往用用于遗传传毒理学学试验中中，确定定指示生生物的生生物学特特征的本本底值，进行质质量控制制。 (2) 阴性性(溶剂赋形剂剂)对照：不给处处理因素素但给以以必须的的实验因因素(溶剂赋形剂剂)，以排排除此实实验因素素(溶剂赋形剂剂)的影响响，阴性性对照作作为与染染毒组比比较的基基础。没没有阴性性对照组组就不能能说明受受试物染染毒与有有害作用用之间的的关系。例如，在实验验中，染染毒各剂剂量组实

43、实验动物物出现某某些异常常、甚至至死亡；如果阴阴性对照照组没有有发现异异常，我我们可以以认为此此种异常常和死亡亡是由于于受试物物的毒作作用；如如果阴性性对照组组也出现现同样的的异常和和死亡，则应考考虑是由由于实验验动物患患某种传传染病或或其他非非实验因因素所致致，必须须重新进进行实验验。 (3) 阳性性对照：用已知知的阳性性物(如致突突变物)检测试试验体系系的有效效性。阳阳性对照照组最好好与受试试物用相相同的溶溶剂、染染毒途径径及采样样时间。在遗传传毒理学学试验、致畸试试验和致致癌试验验中都使使用了阳阳性对照照组，阳阳性对照照组是用用已知的的致突变变物、致致畸物或或致癌物物染毒，应该得得到肯定

44、定的阳性性结果(即致突突变性、致畸性性或致癌癌性)。这是是由于这这些试验验，特别别是遗传传毒理学学试验的的变异较较大，为为了进行行质量控控制而设设置阳性性对照组组。当同同时进行行的阴性性(溶剂赋形剂剂)对照组组不能得得到阴性性结果，阳性对对照组不不能得到到阳性结结果，说说明此次次实验质质量有问问题，全全部数据据无效，必须重重新实验验。在遗遗传毒理理学试验验中，阳阳性对照照与受试试物应该该用同样样的途径径和溶剂剂赋形形剂，但但如有困困难，则则不同的的染毒途途径、不不同溶剂剂赋形形剂也可可以接受受。 (4) 历史史性对照照：由本本实验室室过去多多次实验验的对照照组数据据组成，上述三三种对照照都可构

45、构成相应应的历史史对照。历史对对照的最最好用途途是通过过同质性性检验检检查试验验体系的的稳定性性，即进进行实验验室质量量控制和和保证。由于实实验毒理理学的各各种参数数至今尚尚没有公公认的参参考值，因此历历史性对对照均值值及其范范围在评评价研究究结果时时至为重重要。以上所述述适用于于大多数数的毒理理学体内内试验。在急性性毒性试试验测定定LD500或LC500时，剂剂量组数数根据选选用的设设计和统统计学方方法而定定，可以以是4组，也也可以是是57组。根根据预实实验结果果，希望望所设计计的中间间剂量组组的剂量量与最后后得到的的LD500(LCC50)接近。由于急急性毒性性试验的的观察指指标是死死亡，

46、并并伴有严严重的中中毒症状状，对于于有经验验的实验验者可以以不设阴阴性对照照组。当当然，如如果使用用了一种种不常用用的溶剂剂或者要要测定某某种其他他的参数数如MTTD、急急性LOOAELL和NOAAEL，则需要要设置阴阴性对照照组。 2. 各组动动物数毒毒理学安安全性评评价试验验各组动动物数取取决于很很多因素素，如实实验目的的和设计计，要求求的敏感感度、实实验动物物的寿命命、生殖殖能力，经济的的考虑及及动物的的可利用用性。各各组动物物数的设设计应考考虑到统统计学的的要求。对各种种常规毒毒性试验验的动物物数要求求，见以以后有关关章节。 3. 试验期期限某些些试验(如致畸畸试验和和多代生生殖试验验

47、)的试验验期限是是由受试试实验动动物物种种或品系系而决定定的。而而其他毒毒性试验验的期限限在某种种程度上上由定义义所决定定。如急急性毒性性是一次次或1天内多多次染毒毒观察114天，亚慢性性毒性试试验规定定为染毒毒持续至至实验动动物寿命命的100，对对大鼠和和小鼠为为90天，对狗应应为1年。慢慢性毒性性试验致癌试试验一般般规定为为持续至至实验动动物寿命命的大部部分。又又可分为为两类，即规定定试验期期限的试试验，或或直到最最敏感的的组死亡亡率达到到某一水水平(通常为为80)的试验验。二、体外外毒理学学试验设设计此处简要要讨论在在遗传毒毒理学体体外试验验共同考考虑的几几个问题题。 1测测定受试试物溶

48、解解性应该该测定受受试物在在试验介介质中的的溶解性性。已注注意到在在试验系系统暴露露期内，受试物物的溶解解性可能能改变，因为存存在细胞胞、S99、血清清等。因因此，在在试验开开始和结结束时评评价溶解解性是有有意义的的。溶解解性限度度就是出出现沉淀淀的最低低浓度。 2试试验最高高剂量的的推荐对对可溶性性受试物物浓度高高于100mmool/LL时可因因高渗透透压在哺哺乳动物物细胞引引起损伤伤或人工工假象，对细菌菌则无此此影响。由于受受试物的的分子量量并不一一定知道道(如聚合合物或混混合物)，因此此，在大大多数情情况下，可溶性性受试物物的试验验上限应应该是：(1)对哺乳乳动物细细胞为110mmmol

49、/L或5mgg/mll。(2)对细菌菌试验为为5mgg/平板板。当受受试物供供应困难难或非常常昂贵(如生物物药剂)，最高高剂量低低于100mmool/LL或5mgg/mll(或平扳)是可以以接受的的。对不溶性性受试物物最高浓浓度的推推荐有争争论，日日本学者者的资料料表明，有的受受试物仅仅在沉淀淀剂量于于细菌试试验和染染色体畸畸变试验验中出现现遗传毒毒性。哺哺乳动物物细胞具具有吞噬噬作用，细菌不不具有吞吞噬作用用。一般般认为无无毒性的的可溶于于适当的的溶剂而而不溶于于实验培培养液(介质)中的受受试物，最高浓浓度应是是溶解性性限制(即产生生沉淀的的最低浓浓度)，但不不应干扰扰终点的的计数。对于有毒

50、毒性的受受试物，最高浓浓度在细细菌试验验中应该该是明显显显示毒毒性的剂剂量，对对哺乳动动物细胞胞试验最最高剂量量，基因因突变试试验应达达到100200存活活率，而而染色体体畸变和和UBSS试验应应达到550存存活率。对于没有有适当溶溶剂，完完全不溶溶的受试试物，则则可以按按5mgg/平板板或100mmool/LL(5mmg/mml)进进行实验验以检测测杂质的的致突变变性。或或者，采采用生理理盐水提提取物进进行实验验。 3. 代谢活活化代谢谢活化常常规使用用Aroocloor 112544（多氯氯联苯112544）预处处理的雄雄性成年年大鼠肝肝匀浆9900000g离离心上清清液(SS9)，及相应

51、应的辅因因子(NNADPPH再生生系统)。由于于各国禁禁用限用用多氯联联苯，可可用苯巴巴比妥和和-萘黄黄酮联合合诱导制制备S99(Ell1ioott，19992)。对体外外哺乳动动物细胞胞试验，还可利利用大鼠鼠肝原代代培养细细胞等作作为代谢谢活化系系统。 4. 阳性对对照阳性性对照的的剂量应应选择其其剂量-反应的的直线部部分，并并且构成成历史性性资料(历史性性对照)，并以以其作为为实验质质量控制制的措施施之一5. 重重复由质质控良好好的实验验得到明明确的阴阴性结果果和阳性性结果，不强调调要求重重复。可可疑结果果则应重重复实验验，最好好改变剂剂量范围围剂量量间隔、改变SS9浓度度或改变变实验方方

52、法进行行重复。 实验动物物的柒毒毒和处置置本节简要要介绍在在动物实实验前的的实验动动物准备备、受试试物的准准备、染染毒途径径和方法法、动物物处死和和生物标标本采集集的基本本内容，详细的的方法和和步骤请请查阅有有关的毒毒理学实实验方法法专著。一、动物物实验前前的准备备实验动物物在购进进之后，应雌雄雄分开饲饲养。一一般应进进行57天的检检疫，在在此期间间应多次次观察动动物，及及时剔除除不健康康的动物物。观察察期结束束，将实实验动物物按实验验设计的的要求进进行标记记和分组组。实验动物物的标记记方法对对啮齿动动物常用用染色法法，可用用苦味酸酸(黄色)、品红红(红色)的酒精精饱和溶溶液在动动物被毛毛上染

53、色色，不同同的颜色色和染色色部位表表示不同同的编号号，可标标出199号。由于被被毛上颜颜色会逐逐步消失失，故需需重复染染色。对对啮齿动动物还可可用剪耳耳法标记记。对狗狗等大动动物一般般用挂牌牌法。实验动物物分组的的原则要要求所有有的动物物分配到到各剂量量组和对对照组的的机会均均等，避避免主观观选择倾倾向，减减少偏性性，以保保证结果果的准确确可靠。正确的的分组方方法是随随机分组组。实验验动物按按性别、体重顺顺序编号号，然后后利用统统计学的的随机数数字表，按完全全随机分分组法或或配伍组组随机分分组法，将实验验动物分分配到各各剂量组组和对照照组。然然后应计计算各组组实验动动物体重重的均值值和标准准差

54、，必必要时可可将实验验动物适适当调组组，以使使各组实实验动物物体重的的均值的的差别不不超过允允许范围围。二、受试试物和样样品的准准备应了解受受试物的的纯度及及杂质成成分，了了解受试试物的化化学结构构和理化化性质，特别是是其挥发发性和溶溶解性。查阅文文献，检检索与受受试物化化学结构构和理化化性质相相似的化化合物的的毒性资资料，以以作参考考。对各各个毒理理学试验验应该用用同一种种、同一一批号受受试物。受试物物成分和和配方必必须固定定。如是是异构体体混合物物，异构构体比例例必须固固定。活活性成分分的百分分含量和和可检测测的杂质质的浓度度也应固固定。受受试物在在贮存期期内稳定定性和在在饲料中中的稳定定

55、性必须须进行研研究并报报告。受受试物应应一次备备齐全部部实验的的用量。所需受试试物总量量(AABCD)1.2式中：AA为每组组动物数数；B为各处处理组的的剂量和和(如0.1+00.3+11.0mgg/kgg1.4mgg/kgg)；C为染毒毒次数(通常为为天)；D为动物物的平均均体重；1.2为安全全因子，防止损损耗。染毒前根根据染毒毒途径的的不同，应将受受试物制制备成一一定的剂剂型。常常用的是是制备成成水溶液液、油溶溶液或混混悬液。对溶剂剂和助溶溶剂的要要求是，所用的的溶剂或或助溶剂剂应该是是无毒的的，与受受试物不不起反应应，受试试物在溶溶液中应应稳定。对水溶溶性受试试物，体体内试验验适当的的溶

56、剂为为水(经口染染毒)和等渗渗盐水(胃肠道道外染毒毒)。水不不溶性受受试物应应溶于或或悬浮于于适当的的有机溶溶剂中。天然植植物油(如玉米米油，橄橄榄油)可以用用作为溶溶剂，有有两个缺缺点，即即不可能能保证得得到成分分完全一一致的植植物油，植物油油中的抗抗氧化剂剂成分等等可影响响受试物物的毒性性遗传传毒性。二甲基基亚矾(DMSSO)不不适用于于体内实实验，因因其毒性性较高，并且溶溶于DMMSO的的受试物物在染毒毒后出现现沉淀。新药安全全性评价价推荐混混悬液赋赋形剂为为0.5羧甲甲基纤维维素钠或或10阿阿拉伯树树胶；受受试物溶溶液应新新鲜配制制，除非非已证明明贮存稳稳定。其其他的剂剂型见下下文染毒

57、毒途径的的介绍。外源化学学物用溶溶剂稀释释，一般般讲浓溶溶液比稀稀溶液毒毒性大，但是也也有的外外源化学学物稀释释之后毒毒性反而而增加，即存在在所谓“稀释毒毒性”，其原原因尚不不清楚。在准备染染毒制剂剂时的要要点：在准备备制剂时时加热受受试物不不应接近近改变其其化学性性质或物物理性质质的温度度。如受试试物为固固体，并并且评价价其对皮皮肤的毒毒性，应应保持其其形状和和颗粒大大小。多成分分的受试试物(混合物物)应按配配方配制制，以使使染毒制制剂准确确地反映映原混合合物(即其成成分不应应被选择择性地悬悬浮或溶溶解)。制剂应应保持化化学稳定定性和受受试物的的一致性性。制剂应应减少总总试验容容积，利利用溶

58、剂剂或赋形形剂的量量不应过过多。制剂应应易于准准确染毒毒。如可能能，制剂剂pH应为为59。不应用用酸或碱碱使受试试物解离离(基于保保护动物物的原因因，并避避免改变变肠道或或肾小管管内的PPH)。如果应应用非胃胃肠道途途径，终终溶液应应尽可能能接近等等渗。 对于于各种染染毒途径径的最大大容积，以受试试的实验验动物物物种或制制剂来确确定。一一般规定定，染毒毒最大容容积为：经口200ml/kg(对空腹腹动物);经皮2mml/kkg(根根据体表表面积计计算，限限于染毒毒的准确确性)；静脉1mml/kkg(55分钟以以上)；肌肉注注射0.5mll/kgg(一个个部位)；每眼0.01mml;直肠0.5ml

59、l/kgg；阴道：大鼠00.2m11，兔1mml；吸人2mmg/LL；鼻：猴猴或狗每每鼻孔00.1mml。染毒的的通常容容积(最大容容积)：大鼠鼠灌胃为为1.0(33.0)ml1000g体重重(BWW)，静静注为00.5(3.00)mll1000g BBW ;小鼠灌灌胃为00.2(1.00)mll/200g BBW，静注注为0.2(00.5)ml/20gg Bww；狗灌灌胃为550(1100)ml/10 kg Bw，静注为为30(50)ml10kgg BWW。各种种规范可可能有不不同的规规定，应应按规定定进行。三、染毒毒途径毒理学试试验中染染毒途径径的选择择，应尽尽可能模模拟人在在接触该该受试

60、物物的方式式。最常常用的染染毒途径径为经口口、经呼呼吸道、经皮及及注射途途径。不不同途径径的吸收收速率，一般是是：静脉脉注射吸入肌肉注注射腹腹腔注射射皮下下注射经口皮内注注射其其他途径径(如经皮皮等)。 1. 经口(胃肠道道)染毒常用用有灌胃胃、喂饲饲和吞咽咽胶囊等等方式。 (1) 灌胃胃：将受受试物配配制成溶溶液或混混悬液，以注射射器经导导管注入入胃内。一般灌灌胃深度度从口至至剑突下下，最好好是利用用等容量量灌胃法法，即受受试物配配制成不不同浓度度，实验验动物单单位体重重的灌胃胃容量相相同。大大鼠隔夜夜禁食，小鼠可可禁食44小时(因小鼠鼠消化吸吸收和代代谢速度度较快)，均不不停饮水水。灌胃胃