混合物红外光谱分析的关键方法和技术

1、孙素琴清华大学化学系复杂混合物红外光谱分析的关键方法和技术中药等复杂混合物质量控制的难题成分2成分1 成分复杂多样，难以完全逐一分离并检测指标成分不够全面不能准确反映中药药效和质量难以鉴别药材产地等多种属性无法安全控制其他大多数成分检测困难检测方法复杂且检测成本过高缺乏定性分析而导致定量错误人为添加可改变指标成分含量“先分离，后分析”的混合物分析路线一般分析过程中首先要从混合物中分离出相应的纯组分，然而分离并不等同于分析。分离只是将混合物分解为不同部分，而各部分的结构和含量确定还需要多种分析方法相结合。对混合物进行分离，不可避免对原成分造成影响，分离所得物质与原始成分往往具有一定的差异。对混合

2、物进行分离，很难直接观察到各种成分共存时的相互作用。对混合物进行分离并对所有组分逐一分析，需要消耗大量的时间、人力和物力。“先分离，后分析”的混合物分析路线实际过程中研究者们往往只关注所感兴趣的一小部分分离产物，不能够得到混合物整体成分信息。如果提取分离方法不恰当，就无法得到待测样本中所含有的全部的目标成分，而且会在分离产物中混入其他杂质成分。如果对于分离产物没有进行准确的定性分析，就可能将杂质成分与目标成分混淆在一起，影响定量分析的准确性。中药成分信息的多维层次结构与合理分析原则全部成分部分成分单一成分主体成分少量成分微量成分定性信息定量信息宏观整体样本微观局部样本渐进式分析：从整体到部分，

3、先定性后定量有些信息只要粗略了解，有些信息必需细致分析中药等复杂混合物质量控制的合理路线中药整体定量部分定性全部成分，指纹图谱特定成分，定性定量混合物分析：从整体到部分，层层深入整体：完整样本，所有成分部分：局部样本，特定成分兔子血管壁（可见图像）红外图像(化学图像)血管壁胆固醇结块局部样本红外光谱(化学成分)蛋白质脂肪混合物分析：先定性后定量，准确无误蛋白质N转化为NH4+NH3三聚氰胺蛋白质含量分析三聚氰胺未知物定性: 是不是？定量: 有多少？为什么选择红外光谱？红外光谱是一种无需标记的分析技术，在没有先验知识的情况下即可使用；既可以同时获取混合物中整体成分信息，又可以对特定成分进行有针对

4、性的检测。随着计算机与化学计量学技术的发展，红外光谱不仅可以对混合物成分进行详细的定性分析，还可以对特定成分进行相当准确的定量分析。红外光谱既可以对较大尺寸的混合物样品进行分析，也可以借助显微镜对纳克级的微小样品进行检测，还可以研究宏观样本中微米级的局部区域。丰富灵活的采样技术使各种形态样品的红外光谱测试都可以做到简便、快速、无损，仪器通用，成本低廉，环境友好。红外光谱适合与其它分析技术联用，获得全面的样品信息。“不分离，即分析”的混合物分析路线简化步骤而节约时间和成本得到样本全部成分整体信息获取各种成分相互作用信息避免指标成分分析种种弊端“边分离，边分析”的混合物分析路线要对混合物进行全面准

5、确的分析研究，应该遵循“从整体到部分，先定性后定量”的路线原则，在红外光谱的指导下，对混合物进行逐步分离与分析。红外光谱可以提供混合物整体成分信息，指导进一步的分离分析；红外光谱可以监督各步分离产物的成分，检查分离方法的合理性，拣选含有目标成分的分离产物；红外光谱可以用于解析和确认各种分离组分的结构“边组合，边分析”的混合物分析路线对混合物进行分析研究，了解其构成与性质的联系，能够为得到具有更优异性质的混合物提供指导。在混合物组合过程中，红外光谱可检查原料的正确性及其纯度，避免错误原料和过量杂质的引入；可监控组合过程，及时发现组合过程中出现的异常，为过程工艺的优化提供信息；可对中间产物进行快速

6、分析，避免不合格产物进入下一环节而导致不必要的损失；可对最终产物进行定性定量分析，检查其是否合乎相应的要求。混合物的红外光谱纯化合物多组分混合物混合物光谱成分A光谱成分B光谱成分C光谱定量分析混合物红外光谱可以提供的信息定性分析整体样本/局部区域整体成分特定成分混合物红外光谱解析的三大难题根源：成分复杂，谱图重叠样本分辨难如何获得优质谱图如何提高分辨能力如何增加信息表达成分解析难如何解析主体成分如何解析特定成分如何解析相对含量谱图分析难如何智能化解析如何智能化鉴别如何智能化定量混合物红外光谱宏观指纹特征Wavenumber/cm-1Absorbance同种官能团吸收峰相邻，重叠峰给出物质群组信

7、息邻、间、对二甲苯混合物混合物红外光谱宏观指纹特征邻二甲苯间二甲苯对二甲苯等体积混合物光谱加和Wavenumber/cm-1Absorbance混合物光谱包含各组分特征峰混合物红外光谱宏观指纹特征Wavenumber/cm-1Absorbance特征峰表现与浓度和重叠程度有关间二甲苯90% 间二甲苯50% 间二甲苯33% 间二甲苯5% 间二甲苯混合物红外光谱宏观指纹特征p-m-m-o-Wavenumber/cm-1Absorbance邻、间、对二甲苯 1 ：1 ：1 2 ：1 ：1 1 ：1 ：2 1 ：2 ：1成分种类或含量不同，混合物光谱不同混合物红外光谱解析方法多级红外光谱宏观指纹分析法

8、multilevel infrared spectral macro-fingerprints analysis使用多级光谱增强谱图分辨能力根据特征谱峰进行相应组分解析借助统计方法实现客观量化分析混合物红外光谱解析的三大方法多级红外光谱宏观指纹分析法三级鉴别法传统红外光谱二阶导数光谱二维相关光谱整体解析法主体成分解析特定成分解析相对含量比较专家识别法光谱数据库检索相似度量化比较多组分定量分析红外光谱三级鉴别法一级鉴别（the primary identification）普通红外光谱Conventional Infrared Spectroscopy, conventional IR二级鉴别（

9、the secondary identification）二阶导数红外光谱Second Derivative Infrared Spectroscopy, SD-IR三级鉴别（the tertiary identification）二维相关红外光谱Two-dimensional Correlation Infrared Spectroscopy, 2D-IRInfrared Spectral Tri-step Identification普通红外光谱精密度，准确度，信噪比，分辨率Wavenumbers / cm-1AbsorbanceCO2和H2O干扰扣除1.00000.99970.99981

10、.00000.9998相关系数平均光谱标准差光谱重复性二阶导数红外光谱二阶导数红外光谱：葡萄糖/乙醇-水溶液FTIR12%乙醇20 g/L葡萄糖12%乙醇60 g/L葡萄糖12%乙醇100 g/L葡萄糖12%乙醇Wavenumbers / cm-1SDIRWavenumbers / cm-1二维相关红外光谱OriginalDynamic2DCOS二维相关红外光谱：葡萄糖/乙醇-水溶液108510441152110710851065104410249921152110710851044102499211071085104499212%vol乙醇-水20 g/L葡萄糖12%vol乙醇-水60 g/

11、L葡萄糖12%vol乙醇-水100 g/L葡萄糖12%vol乙醇-水真伪阿胶：第一级鉴别Wavenumbers / cm-1Absorbance东阿阿胶假阿胶真伪阿胶：第二级鉴别Wavenumbers / cm-12nd derivative 东阿阿胶假阿胶真伪阿胶：第三级鉴别假阿胶东阿阿胶v混合物红外光谱解析的三大方法多级红外光谱宏观指纹分析法三级鉴别法传统红外光谱二阶导数光谱二维相关光谱整体解析法主体成分解析特定成分解析相对含量比较专家识别法光谱数据库检索相似度量化比较多组分定量分析主体成分解析官能团分析脂肪蛋白质糖类 全脂奶粉（104）奶粉的红外光谱中药主体成分解析：蛋白质羚羊角麝香水蛭

12、相思子Wavenumbers / cm-1Absorbance中药主体成分解析：蛋白质1639Wavenumbers / cm-12nd derivative羚羊角麝香水蛭相思子中药主体成分解析：油脂火麻仁芥子莱菔子乌梅 Wavenumbers / cm-1Absorbance中药主体成分解析：油脂火麻仁芥子莱菔子乌梅 285417472nd derivative / Wavenumbers / cm-1/特定成分解析标准品比较ABC乳糖Wavenumbers / cm-1Absorbance特定成分解析标准品比较乳糖样品A样品B样品C峰位置/cm-1(阈值0.01A)352933823345

13、352433803343338029782934290129002901147014561436145614391457144014571440138313671359138113671359138213801341129612611341129612611342126013431260120211681142120211671143120111661143120211631143111610941083111610941083111610931116107110581034107110581035107110581036107010371019100498710199881020989989

14、915899875915898876915898876914898875778671631779631779631779632604566551605566551604552604551467445434468434469469对应峰个数39332520相同峰个数391875相关系数1.00000.91240.80980.6436特定成分解析标准品比较Wavenumber / cm-1Absorbance白鲜皮地骨皮桑叶银杏叶草酸钙中药指标成分解析：黄连Wavenumbers / cm-1Absorbance黄连药材盐酸小檗碱中药指标成分解析：黄连Wavenumbers / cm-12nd d

15、erivative黄连药材盐酸小檗碱中药指标成分解析：淫羊藿Wavenumbers / cm-1Absorbancea.脱水淫羊藿素b.宝藿苷Ic.箭叶苷Bd.淫羊藿苷e.淫羊藿定Bf.淫羊藿定Cg.淫羊藿属苷Ah.意卡瑞甙Ci.山奈酚j.槲皮素R=HR=CH3中药指标成分解析：淫羊藿IRHPLCIRHPLC相对含量比较相对峰强度脂肪蛋白质糖类全脂奶粉低脂奶粉脱脂奶粉Wavenumbers / cm-1Absorbance相对含量比较相对峰强度鹿茸鹿角鹿角霜磷酸钙Wavenumber / cm-1Absorbance混合物红外光谱解析的三大方法多级红外光谱宏观指纹分析法三级鉴别法传统红外光谱二

16、阶导数光谱二维相关光谱整体解析法主体成分解析特定成分解析相对含量比较专家识别法光谱数据库检索相似度量化比较多组分定量分析数据库检索纯化合物数据库五倍子药材样本在Sadtler谱库中检索结果数据库检索混合物数据库unknown samplethe 1st hit模式识别-基本概念模式识别（Pattern Recognition）就是分类。客观存在可以观察的事物，如果可根据一定规则进行相似性判别，都可称之为模式。模式识别就是通过特定方法将样本分成有实际意义的类别。模式识别是人工智能技术的分支，它试图用计算机代替人工对各种模式进行描述、分类和决策，从中找出规律，达到识别事物的目的。原始数据（训练集）

17、特征提取训练与分类分类规则未知样本分类结果方法的选择光谱比对某一样品与一系列参考光谱比较简单，易操作单个样品即可需要选择各种“数学过滤器”降低制样带来的影响模式识别一组样品进行比较方法灵敏至少需要5个样品需要借助数学方法进行识别数据预处理原始量测数据同一样本的不同性质不同样本的同一性质X为m个样本在n个变量处的测量值，比如测量m个样本在n个波数处的吸光度值而得到的红外光谱，也可以是m个样本中n种成分的含量。数据预处理不同样本的同一性质中心化自动调整值域调整数值归一化模长归一化权重调整相似性方向余弦相似性系数相关系数相似性越大样本间越相像相似度量化相关系数相关系数产地相关系数产地相关系数产地1.

18、0000河南武陟0.9822河南武陟0.9738广东0.9922河南武陟0.9821河南温县0.9733云南0.9898河南博爱0.9817河南温县0.9623山西太谷0.9890河南修武0.9815河南武陟0.9606河北安国0.9885河南温县0.9814河南武陟0.9605山西襄汾0.9877河南武陟0.9813河南沁阳0.9600山西汾阳0.9872河南沁阳0.9809河南武陟0.9578山西平遥0.9868河南孟县0.9794山东单县0.9544山西平遥0.9865河南武陟0.9793河北安国0.9516山西太谷0.9854河南温县0.9781山西平遥0.9422山东济宁0.9842

19、河南温县0.9776陕西西安0.9402广西0.9837河南温县0.9772广东0.9214山西汾阳0.9830河南温县0.9765山西曲沃0.9101浙江东阳0.9825河南温县0.9762河北安国0.8881河北安国0.9824河南孟县0.9754山西平遥0.8486山西平遥怀山药不同产地山药与对照品的相关系数（1590-1390cm-1）是不是相关系数比较相似度量化模式识别山药基本原理单组份定量（单波长定量） 多组份定量（谱图重叠，全谱定量）A = K C工作曲线法实例根据中药配方颗粒的红外光谱确定其中辅料含量不同糊精含量的丹参配方颗粒的红外光谱图a.0.0, b.9.97, c.20.

20、55, d.29.81, e.39.82, f.49.80, g.59.62, h.100%工作曲线法实例相对峰强度的计算峰强度的计算工作曲线法实例丹参配方颗粒糊精工作曲线法实例根据奶粉的红外光谱确定其中乳糖含量决定系数奶粉奶粉+乳糖乳糖组分定量分析工作曲线糊精质量分数糊精峰高1021cm-1, A1药材峰高1611cm-1, A2相对峰强度A1/A2相对峰强度对数lg(A1/A2)0.0%0.81010.93650.8650-0.063012.0%0.86580.77581.11600.047722.2%0.90690.64641.40310.147129.3%0.97240.63881.5

21、2220.182544.0%0.96830.47022.05930.313749.7%0.96960.43122.24870.351958.6%0.98190.36922.65940.4248基线起止2000-880cm-1相关系数R0.99110.9986白扁豆药材糊精 多元线性回归K矩阵与P矩阵主成分回归偏最小二乘回归多组分定量分析选择标准样品集：定标集、验证集其他方法获得参照值：HPLC、GC确定化学计量学的算法PCA 主成分分析（定性）PCR+ - 增强的主成分回归PLS1 偏最小二乘法（单组分）PLS2 偏最小二乘法（多组分）选择合适的光谱参数：范围、预处理模型评价：R2、SEE、S

22、EPPage 64 模型评价定标集的决定系数R2判断一个定标集模型的好坏定标标准差SEE 反映定标集数据点标准偏差预测标准差SEP给出一个独立样本在标准集中预测时所产生的误差RSS = 残差的平方和SYY = 总的方差组分定量分析多元校正1700-900cm-1SNV+De-trending二阶导数R2=0.992SEE=0.001806SEP=0.00011311600-900cm-1SNV+De-trending二阶导数R2=0.997SEE=0.000572SEP=0.0000879黄芩苷绿原酸双黄连粉针剂指标成分定量分析分离提取过程丹参丹参药材95%醇提残渣95%醇提物95%醇提丹参酮

23、IIA分离提取过程丹参95%醇提物滤液沉淀（总酮）加水溶解分离提取过程丹参加水提取95%醇提残渣水提物水提残渣分离提取过程丹参加醇至70%95%醇提残渣水提物滤液沉淀（多糖）水苏糖丹酚酸B分离提取过程丹参乙酸乙酯萃取95%醇提残渣水提物醇沉滤液水层酯层（总酸）丹参酮IIA水苏糖丹酚酸B分离提取过程丹参分离提取过程甘草药材水提10%醇提20%醇提90%醇提100%醇提甘草苷黄酮类成分增加糖类酸类成分减少分离提取过程甘草甘草药材95%醇提物95%醇提残渣分离提取过程甘草甘草药材95%醇提物总黄酮甘草苷乙酸乙酯萃取分离提取过程甘草甘草药材95%醇提残渣10%醇提物10%醇提残渣分离提取过程甘草10%醇提物60%醇沉沉淀60%醇沉滤液含糖醛酸（酯）的多糖分离提取过程甘草总皂苷10%醇提物60%醇沉滤液甘草酸铵加酸沉淀分离提取过程甘草甘草药材残渣皂苷黄酮多糖红外光谱法用于中药等混合物分析的三大特性快速、简便、直接、无损、全面一次性仪器购置一次性样品测试一次性谱图分析一次性真实性无预处理存原本性反映全部成分信息跟踪组分变化规律可控性同样本重复性仪器间重现性操作者一致性红外光谱相对于色谱的优势仪器重现性同一个样本在所有仪器上得到的红外谱图都是一致的，不受测试时间、地点以及操作人员等因素影响；对标准物质进