自制脂质纳米泡联合低功率超声治疗肿瘤的实验探究

1、A Dissertation Submitted to Huazhong University ofScience and Technology for the Degree of Master of MedicineExperimental Study on Tumor Therapy by Home-made Lipid Nanobubbles combined with Low- power UltrasoundCandidate : Qian ChaoMajor:Imaging and Nuclear MedicineSupervisor : Prof. Chen YunchaoDep

2、artment of Ultrasonography, Tongji hospitalHuazhong University of Science and TechnologyWuhan, Hubei, P. R. ChinaApril, 2014独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者

3、完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在 _年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在以上方框内打 ）学位论文作者签名：日期：年月日指导教师签名：日期：年月日目录英文缩略词1中文摘要2Abstract4论文正文引言7实验材料9实验方法10实验结果14讨论22结论27参考文献28综述31致谢44硕士在读期间书写的文章45华中科技大学硕士学位论文英文缩略词英文缩写英文全

4、称CEUSContrast-enhancedUltrasoundPIPeak IntensityMVDMicrovesselDensityDMEMDulbecco s modified Eagle s mediumPBSPhosphate Buffered SalineDSPC DistearoylPhosphatidyl CholineDSPE-PEG 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamineROIRegion of InterestNBNanobubblem MicrometerMIMechanical Indexml Millilit

5、erdB DecibelMHzMillionhertzH-E Hematoxylin-EosinCDFIColor Doppler Flow ImagingUCA UltrasoundContrast AgentTIC Time-IntensitycurveCPSContrast Pulse SequencingHIFUHigh Intensity Focused UltrasoundIHC Immunohistochemistrynm Nanometer中文全称超声造影峰值强度微血管密度改良的伊格尔培养基磷酸缓冲液二硬脂酰磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 -聚乙二醇感兴趣区纳米泡微米机械指数

6、毫升分贝兆赫兹苏木精 -伊红彩色多普勒血流成像超声造影剂时间 -强度曲线对比脉冲序列高强度聚焦超声免疫组织化学纳米1华中科技大学硕士学位论文自制脂质纳米泡联合低功率超声治疗肿瘤的实验研究华中科技大学同济医学院附属同济医院超声影像科硕士研究生：钱超导师：陈云超教授摘要目的研究自制脂质纳米泡联合低功率超声对结肠癌鼠皮下移植瘤的治疗效果；对比相同质量浓度的不同微泡联合低功率超声对肿瘤的治疗效果；探讨自制纳米泡联合不同功率参数的低功率超声对肿瘤的治疗效果。方法建立 44 只 Balb/C 裸小鼠皮下结肠癌移植瘤模型，随机分成4 组：组1(n=16)作为对照组，组2(n=6) Sonovue联合1.5w

7、/cm2 低功率超声（Low-powerUltrasound，L-US ）治疗，组 3（n=16）自制纳米泡（ Nanobubble，NB ）联合 1.5w/cm2L-US 治疗，组 4（ n=6）NB 联合 2.5w/cm2 L-US 治疗。在治疗前、治疗后即刻、1h、24h、48h 五个时间点，对各组行超声造影（Contrast-enhanced Ultrasound，CEUS）检查，运用统计学方法比较各组间治疗前后各时间点的显影声强度（Video Intensity ，VI ）的差异。在治疗后即刻、1h、24h、72h 四个时间点，完成CEUS 后对组 1 和组 3中的 4 只处死取肿瘤

8、组织行各时间点两组肿瘤组织切片的HE 染色、免疫组化CD31染色和治疗后72h 时间点两组肿瘤组织切片的免疫组化Ki67 染色，观察各时间点两组病理结果的差异；对治疗后24h 时间点的两组的CD31 染色片子进行微血管密度Microvessel Density ，MVD ）计数，对治疗后 72h 时间点的两组的 Ki67 染色片子进行 Ki67 标记计数，并运用统计学方法比较两组间MVD 和 Ki67 标记计数的差异。结果与组 1 相比，组 2、组 3、组 4 在治疗后即刻和治疗后1h VI 都显著降低，差异有显著统计学意义（P0.05）；组 4 与组 3 相比，两者 VI 差异在治疗后即刻、

9、 1h、24h 均有统计学意义（ P0.05）。HE染色：组 1 各时间点：肿瘤组织结构完好；组3 治疗后：肿瘤细胞形态结构破坏； CD31 染色：组 1 各时间点：肿瘤组织内可见大量微血管，结构完好；组 3 治疗后：微血管明显减少，结构破坏。治疗后24h，组 3 的 MVD值明显2华中科技大学硕士学位论文低于组 1，差异有显著统计学意义（ P0.01） ；治疗后 72h，组 3 的 Ki67 标记计数值明显低于组 1，差异有显著统计学意义（ P0.01） 。结论自制脂质纳米泡联合低功率超声能够破坏肿瘤的微血管和肿瘤组织，引起细胞增殖减低， 发挥治疗作用； 自制脂质纳米泡联合 1.5w/cm2

10、 低功率超声对肿瘤血供的抑制大于相同质量浓度的微米级微泡 Sonovue联合低功率超声； 自制脂质纳米泡联合 2.5w/cm2 低功率超声对肿瘤血供的抑制时间和抑制程度大于自制脂质纳米泡联合 1.5w/cm2 低功率超声。关键词纳米泡低功率超声移植瘤超声造影微血管密度3华中科技大学硕士学位论文Experimental Study on Tumor Treatment byHome-made Lipid Nanobubbles combinedwith Low- power UltrasoundDepartment of Ultrasonography ， Tongji Hospital, To

11、ngji Medical College,Huazhong University of Science and Technology Postguaduate： Qian ChaoInstructor ： Prof.Chen YunchaoAbstractObjectiveTo investigate the effect of physical therapy in mice coloncancer xenografts by home-made nanobubbles combined with low-powerultrasound by comparing the effect of

12、different bubbles with different powerparameters.Method44 Balb/C nude mice xenograft models of colon cancerwere established and they were randomly divided into 4 groups：Group1(n=16) as a control group ， Group 2 （ n=6） were treated with Sonovue combined with Low-power Ultrasound of 1.5w/cm 2， Group 3

13、 （n=16 ）weretreated with nanobubbles(NB) combined with Low-power Ultrasound of1.5w/cm 2，Group 4 （ n=6） were treated with NB combined with Low-power Ultrasound of 2.5w/cm 2.At five time points of before， immediately ，1h，24h and 48h after4华中科技大学硕士学位论文treatment，the mice were given Contrast-enhanced ult

14、rasound（ CEUS） toobtain the tumor CEUS imaging and video intensity （ VI ）for analysis later At four time points of immediately ，1h，24h and 72h after treatment ，the mice ofgroup 1 and 3 were sacrificed immediately after CEUS for HE， CD31 andKi67 staining ， but Ki67 staining only for tumor tissue at t

15、he time point of 72hafter treatment The pathological results of the two groups at each time pointwere observed Ki67 tag count and microvessel density(MVD) count weredone for analysis.ResultsCompared with group 1 ，the VI of group 2 ，3 and 4 at thesetwo time points of immediately and 1h after treatmen

16、t was significantly low（P0.05）；At time points of immediately ，1h and 24h after treatment ， the difference of VI between group 4 and 3 was significant statistically (P0.05 ） .The results of HE staining: for the group 1 at all time points, thestructures of tumor tissue were intact；for the group 3 afte

17、r treatment, themorphology and structures of the tumor cells were destroyed. The results of CD31 staining: for the group 1 at all time points, a large number ofmicrovessles within the tumor tissue were seen， and the structures ofmicrovessles were intact ；for the group 3 after treatment, the number o

18、f microvessles was significantly reduced, and the structures of microvessles were damagedAt 24h after treatment ， the MVD count of the group 3 was significantly lower than that of group 1 （P0.01）；At 72h after treatment ，the Ki67 tag count of group 3 was significantly lower than that of the group 15华

19、中科技大学硕士学位论文（P0.01 ）Conclusion Tumor treatment can be achieved by home-made lipid nanobubbles combined with low- power ultrasound by destruction of tumor tissue and tumor microvessles.The time of tumor blood supply suppressed by NB+L-US of 1.5w/cmwas longer than Sonovue+L-US of 1.5w/cm2 in same bubbl

20、e massconcentration ；The effect of treatment on VI was was not statistically different between Sonovue+L-US of 1.5w/cm 2 and NB+L-US of 1.5w/cm 2 in samebubble mass concentration.The time of tumor blood supply suppressed by NB+L-US of 2.5w/cm was longer than NB+L-US of 1.5w/cm 2； The effect of treat

21、ment on VI by NB+L-US of 2.5w/cm 2 was significantly larger than NB+L-US of 1.5w/cm 2.22Key words:nanobubble low-power ultrasound xenograft CEUS MVD6华中科技大学硕士学位论文自制脂质纳米泡联合低功率超声治疗肿瘤的实验研究引言肿瘤能够生长和转移，有赖于肿瘤的新生血管的形成。因此，想要使肿瘤缺血、缺氧、凋亡和坏死，可以通过阻断肿瘤血管的生成，那么肿瘤生长就会受到抑制并且细胞转移便会减少。传统的介入方法治疗肿瘤主要针对较大的营养血管，不能有效栓塞小的滋养

22、血管，而且对于多发、散在的肿瘤组织也难通过手术或血管介入栓塞治疗；现有的针对肿瘤新生血管特异性靶点的生物或化学药物不良反应较多，疗效也不甚理想1 。临床上迫切需要一种靶向阻断肿瘤新生血管的治疗方法。超声空化效应引发的机械效应可以对组织细胞造成损伤， 加上微泡作为人为空化核的引入，降低了空化阈值，提高了空化效应。相比瘤周正常血管，肿瘤血管对空化效应的反应更敏感，因此超声空化治疗对肿瘤血管具有靶向性2 ; 已有研究表明，低频超声辐射超声微泡造影剂，可损伤血管内皮3 ，从而激活内、外源性凝血途径，使微血管内血栓形成，从而引起栓塞，肿瘤缺血坏死。抗血管生成治疗作为继放疗、化疗、免疫治疗后新的非手术治疗

23、肿瘤方法，在肿瘤治疗中日益受到重视，但疗效评价是亟需解决的问题。CD31 能够标记肿瘤血管内皮细胞，通过 CD31 免疫组化染色计数MVD ，可以对肿瘤新生血管增生的程度及分布做出判断，是临床上和医学实验中评价血管生成的金标准 4 。但是这种方法仅能用于术后评价微血管密度（ Microvessel Density ，MVD ）。如何能够术前获得肿瘤血管新生信息，指导临床工作，实现个体化治疗，需要新的功能性成像方法，代替MVD 计数评价。超声微泡造影剂多为微米级，目前中国使用的是 Sonovue，它不能通过血管壁，只能在血池中显像，因此能显示肿瘤实质内的微血管5 ，这就克服了传统灰阶超声以及彩色

24、或能量多普勒超声检查存在的缺陷，因此超声造影的出现提高了超声诊断水平。但是临床上常规超声造影诊断用于肿瘤性病变时， 主要依靠诊断者主观的观察和判断，受制于诊断者经验的影响，有一定主观性，如能结合定量技术，量化造影时间7华中科技大学硕士学位论文强度，超声诊断的可重复性可大大提高6 。新的成像技术与造影分析软件的发展，造就了超声分子影像学时代的到来，同时对超声造影剂提出了新的要求，比如：纳米级造影剂、靶向造影剂。要想实现肿瘤特异性靶向显像，超声造影剂需要穿过肿瘤血管到达肿瘤细胞部位，但是临床常用超声造影剂为微米级，只能血池显影，不能穿透血管内皮间隙，并且肿瘤血管内皮间隙虽然较正常组织血管内皮大，但

25、至多700nm，因此粒径小、穿透力强的纳米级超声微泡造影剂，越来越受到人们的关注。本实验所用为自制脂质纳米泡（Nanobubble，NB ），前期已证实其良好的超声造影（ Contrast-enhanced Ultrasound，CEUS）效果，并且利用自制纳米泡进行了基因转染方面的研究 7 ，本次实验检测其与低功率超声（Low-power Ultrasound ， L-US）联合用于肿瘤的抗血管治疗是否有潜在的优势。8华中科技大学硕士学位论文实验材料一、细胞及实验动物：CT26 小鼠结肠癌细胞由同济医院肝外科实验室惠赠；裸小鼠（ Balb/C-nu/nu）（ SPF 级） 50 只，雌性，

26、4-5 周龄，体重 18 2g（购于北京华阜康研究动物有限公司） ，饲养于同济医院动物实验中心无特定病原体（ SPF）环境。二、实验仪器：浴式声振仪 (40 kHz ，100 W ，Branson)、超声破碎仪 (SoNICS)、恒温水浴器（金坛市城西丽华实验仪器厂）；马尔文激光粒度仪 (Nano-ZS90 型)、血球计数板、倒置荧光显微镜 (TS100， Nikon 公司 )；超声治疗仪 (Intelect 2776)；LOGIQ E9 型彩色多普勒超声诊断仪（ GE 公司）。三、实验试剂：DSPC(Sigma）、DSPE-PEG2000（Avanti）、C3F8 (天津核工业理化工程研究院

27、 )；胎牛血清 (Gibco) 、PBS (Gibco)、高糖 DMEM （ Hyclone）、0. 25 % 胰酶 (Gibco)； 1%戊巴比妥钠； SonoVue 超声造影剂 (Bracco 公司 )。9华中科技大学硕士学位论文实验方法一、脂质纳米泡制备（1）制备过程：在刘娜香 8 介绍的方法基础上，制备步骤如下：取干净管型瓶，将一定比例的DSPC 和 DSPE-PEG2000放于其中；加入氯仿 /乙醇，体积比为 9:1，再加入适量 PBS；为获得脂质体，将上述混合物置于 65恒温水浴器中蒸发，直到有机溶剂完全去除；取充满全氟丙烷气体5mL 无菌小瓶，加入上述脂质体悬液2 mL （脂质浓

28、度1mg/mL ），加盖密封后再加压注入全氟丙烷7.5 mL；浴式声振仪中声震上述小瓶10 min 即得脂质纳米泡（ NB ），保存于 4冰箱中，需要时取用。（2）物理性质检测：倒置显微镜及透射电子显微镜观察微泡的形态、分散度及均匀性；马尔文激光粒度仪测量平均粒径和表面电位；血球计数板计算纳米泡浓度。二、细胞培养和裸小鼠皮下结肠癌移植瘤模型的建立（1）细胞培养：选择处于对数生长期的 CT26 细胞，消化细胞采用 0.25%胰蛋白酶，重悬细胞采用无血清的高糖 DMEM 培养基，调整活细胞浓度达 1107 个 /ml。（2）选择裸小鼠右肩背部皮下为接种点， 接种上述细胞悬液 0.1ml/ 只，每只

29、裸小鼠皮下接种一个点。次日记为接种第 1d，待所有荷瘤鼠肿瘤长径达 1cm 时开始进行处理。三、动物分组及处理剔除移植瘤过大或过小的裸小鼠，成功建立裸小鼠皮下移植瘤模型的44 只裸小鼠进行后续实验。10华中科技大学硕士学位论文（1）分组： 44 只裸鼠，随机分为4 组：组 1（对照组， n=16）、组 2（Sonovue+L-US(1.5w/cm2)，n=6）、组 3（NB+L-US(1.5w/cm2)， n=16）、组 4（ NB+L-US(2.5w/cm 2)，n=6）。（2）治疗方案：组 2：将 Sonovue 按照说明配制，经检测浓度为（ 2.0-5.0）108 个/ml ，稀释 10

30、 倍后，每只裸小鼠经尾静脉注入 Sonovue 0.1ml，注射后 15s 开始用脉冲式超声探头辐照肿瘤组织区，输出功率 1.5w/ cm2，占空比 20%，频率 1MHz ，辐照时间 3min；组 3：为使组 3 所用 NB 的质量浓度与组 2 所用 Sonovue 的质量浓度相同，并且每只裸小鼠经尾静脉注入 NB 的体积也为 0.1ml ，经计算，需将提前制备好的原始泡浓度（1.6-3.2） 109 个/ml 调整到（ 0.8-1.6） 109 个/ml 。其它操作同组 2，尾静脉注入NB 后 15s 开始用脉冲式超声探头直接辐照肿瘤组织区，输出功率1.5w/cm2，占空比20%，频率 1

31、MHz ，辐照 3min；组 4：同组 3 所用的 NB ，每只裸小鼠经尾静脉注入NB 0.1ml ，注射后 15s 开始用脉冲式超声探头辐照肿瘤组织区，输出功率2.5w/cm2，占空比 20%，频率 1MHz ，辐照时间 3min；组 1：尾静脉注入 0.1ml 生理盐水，超声探头给予假照。四、CEUS：在治疗前、治疗后即刻、 1h、24h、48h五个时间点，对各组行CEUS 检查。（1）每次实验前裸小鼠用1的戊巴比妥纳（ 0.2ml/20 g 小鼠体重）腹腔注射麻醉，使其俯卧位固定于硬纸板上。（2）先用二维超声检查肿瘤以选定最大直径切面来固定采集影像。（3）LOGIQ E9 型彩色多普勒超

32、声仪选择选择SMP 模式，深度调到 2cm，打开 Contrast模式，实验过程中深度、增益、机械指数、时间增益补偿（TGC）等参数保持一致。（4）尾静脉团注 Sonovue 0.05ml，开始注射按下 “ CLOCK ”，储动态造影视频1min，DICOM 格式保存。（5）应用 GE Logiq E9 型彩色多普勒超声诊断仪自带的分析软件分析造影视频，以病灶整体平均强度做出时间-强度曲线，读出每个动态造影视频的血流灌注参数峰值强度11华中科技大学硕士学位论文（Peak Intensity，PI）。五、病理检查：在治疗后即刻、治疗后1h、24h、72h 四个时间点，CEUS后分别对组 1 和组

33、 3 中的 4只裸小鼠颈椎脱位法处死，连同包膜完整剥离出肿瘤组织，以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，每个肿瘤组织同一位置连续切2 张切片，治疗后 72h 时间点的每个肿瘤组织同一位置连续切3 张切片。（1）HE 染色：HE 染色操作交由谷歌生物公司完成。光镜下观察HE 染色切片。（2）免疫组化 CD31 染色及 MVD 计数：CD31 染色操作交由谷歌生物公司完成。光镜下观察CD31 染色切片，并进行MVD计数。MVD 计数方法：根据 Weidner9 的方法：由两位熟悉肿瘤微血管并经验丰富的病理医师完成。作为记数指标的不是血管腔和腔内的红细胞数，CD31 能把血管内皮细胞被染成棕色，因此界

34、定一个血管如下：染成棕色的细胞和细胞簇、有或无完整管腔结构。巨噬细胞和浆细胞等也可与抗体起反应，因此对识别血管内皮细胞造成干扰。先使用低倍镜 (4)，寻找微血管密度最高的视野，后使用高倍镜 ( 40)，计数染成棕色的微血管。为减少主观因素造成的实验误差， 每人计数 3 个视野的微血管数，取两人的平均值作为 MVD 值。（3）免疫组化 Ki67 染色及 Ki67 标记计数：Ki67 染色交由谷歌生物公司完成。 镜下观察免疫组织化学Ki67 染色切片，并进行 Ki67标记计数。Ki-67 标记计数方法：参照刘军 10 的方法：细胞核中出现棕黄色颗粒的是阳性细胞，每张切片随机观察5 个高倍镜视野，计

35、数1000 个肿瘤细胞中的阳性标记细胞，算出百分数，然后取5 个高倍镜下的平均值。12华中科技大学硕士学位论文六、统计学处理：采用 SPSS 18.0 统计分析软件包。所得数值以均数标准差（x s）表示；各研究组间均数的比较采用单因素方差分析。以检验水准=0.05， P0.05 表示差异有统计学意义。13华中科技大学硕士学位论文实验结果一、脂质纳米泡的制备（1）光镜及透射电镜观察：NB 呈球形，分散均匀，未见明显聚集（图 1）。（2）经检测：平均粒径： 424.4689.32nm；平均表面电位： -（ 2.491.42）mV 。（3）血球计数板计数：制备出的NB 原始泡浓度（ 1.63.2）

36、109 个/ml 。调整到治疗需用泡浓度（0.81.6） 109 个/ml 。图 1 光镜下稀释后的 NB注： A ： (10) NB 分散均匀，未见明显聚集B：( 40)NB 呈球形二、裸小鼠结肠癌CT26 皮下移植瘤模型的建立情况（图2）50 只裸小鼠在研究过程中均成活，生活状态无明显改变，接种后12d，所有裸小鼠右肩背部均出现隆起性肿块，选取其中44 只肿瘤长径约1cm 左右的裸小鼠进入后续实验。14华中科技大学硕士学位论文图 2 裸小鼠结肠癌 CT26 细胞皮下移植瘤模型注：右肩背部可见直径约 1cm 的皮下瘤三、CEUS结果（1）视觉判断（图3）治疗前的各组肿瘤组织及治疗后各时间点的

37、组1：超声造影均可见均匀增强，血流灌注良好无充盈缺损，无显著差异；治疗后即刻：组2、组 3、组 4 肿瘤组织均出现辐照区域充盈缺损，整体几乎无造影剂灌注，呈明显负性显影；治疗后1h、24h：组 2、组 3、组 4 肿瘤组织超声造影仍均可见辐照区域充盈缺损，见于肿瘤中心部；治疗后48h：组 2 肿瘤组织超声造影血流灌注基本恢复，未见明显充盈缺损，组3 和组 4 肿瘤组织内仍可见小的不规则的充盈缺损。15华中科技大学硕士学位论文图 3 两种治疗不同时间点的CEUS注： Sonovue+US 组（ A,B,C,D,E ）NB+US 组（ a,b,c,d,e）治疗前 (A,a) 治疗后即刻 (B,b)

38、 治疗后 1h(C,c) 治疗后 24h(D,d) 治疗后 48h(E,e)（2）VI 分析VI 由 PI 减去造影剂出现前组织本身的声强度值（本底强度）得到。Sonovue+L-US(1.5w/cm2)治疗效果（表 1）：组 2 与组 1 的 VI 相比较：治疗后即刻、 1h，组 2 的 VI 显著低于组 1，差异有显著统计学意义（ P0.05）。说明 Sonovue+L-US(1.5w/cm2) 治疗后维持抑制肿瘤血供达 1h。16华中科技大学硕士学位论文治疗前治疗后即刻 治疗后 1h治疗后 24h 治疗后 48h组 2 30.931.701.520.26 27.67 1.3829.050

39、.85 31.372.21组 1 30.030.9830.80 1.56 31.321.6131.021.61 31.821.53P0.05 0.01 0.05 0.05表 1组 2 与组 1 治疗前后各时间点的VI 值（ ?s，db）NB+L-US(1.5w/cm 2)治疗效果（表 2）：组 3 与组 1 的 VI 相比较：治疗后即刻、 1h，组 3 的 VI 显著低于组 1，差异有显著统计学意义（ P0.01）；治疗后 24h，组 3 的 VI 低于组 1，差异有统计学意义（ P0.05）。说明 NB+L-US(1.5w/cm 2)治疗后维持抑制肿瘤血供达 24h。治疗前治疗后即刻 治疗后

40、 1h治疗后 24h 治疗后 48h组 3 31.052.001.480.29 26.67 2.3328.130.56 30.721.99组 1 30.030.9830.80 1.56 31.321.6131.021.61 31.821.53P0.05 0.01 0.01 0.05表 2组 3 与组 1 治疗前后各时间点的VI 值（ ?s，db）NB+L-US(2.5w/cm 2)治疗效果（表 3）：组 4 与组 1 的 VI 相比较：治疗后即刻、 1h、 24h，组 4 的 VI 显著低于组 1，差异有显著统计学意义（ P0.01）；治疗后 48h，组 2 的 VI 低于组 1，差异有统计学

41、意义（P0.05 0.01 0.01 0.01 0.05表 3组 4 与组 1 治疗前后各时间点的VI 值（ ?s，db）17华中科技大学硕士学位论文 Sonovue+L-US(1.5w/cm2)与 NB+L-US(1.5w/cm 2)比较治疗效果（表4）：组 2 与组 3 的 VI 相比较：治疗后即刻、 1h、24h、48h，组 2 的 VI 与组 3 相比，虽然差异均无统计学意义（ P0.05），但数值上可见组 3 的 VI 均低于组 2。说明自制纳米泡联合 1.5w/cm2 低功率超声对肿瘤血供抑制水平稍强于相同质量浓度的 Sonovue联合 1.5w/cm2 低功率超声。?治疗前治疗后

42、即刻 治疗后 1h治疗后 24h 治疗后 48h组 2 30.931.70 1.520.26 27.671.3829.050.85 31.372.21组 3 31.052.00 1.480.29 26.672.3328.130.56 30.721.99P0.05 0.05 0.05 0.05 0.05表 4组 2 与组 3 治疗前后各时间点的VI 值（ ?s，db） NB+L-US(2.5w/cm 2)与 NB+L-US(1.5w/cm 2)比较治疗效果（表5）：组 4 与组 3 的 VI 相比较：治疗后即刻、 1h、 24h，组 4 的 VI 与组 3 相比，差异有统计学意义（P0.05）。

43、说明自制纳米泡联合 2.5w/cm2 低功率超声在治疗后即刻、 1h、24h 对肿瘤血供抑制水平大于自制纳米泡联合 1.5w/cm2 低功率超声。?治疗前治疗后即刻 治疗后 1h治疗后 24h 治疗后 48h组 4 30.801.84 0.850.37 19.100.9620.751.70 29.431.26组 3 31.052.00 1.480.29 26.672.3328.130.56 30.721.99P0.05 0.05 0.05 0.05表 5组 4 与组 3 治疗前后各时间点的VI 值（ ?s，db）四、HE 染色光镜下观察（图4）：组 1 各时间点：肿瘤组织排列紧密，肿瘤细胞核大

44、深染，组织间未见红细胞渗出；组3 治疗后即刻、 1h：肿瘤细胞排列疏松，血管内皮连续性中断，组织间有大量红细胞渗出，并可见细胞水肿、空泡、囊性变；组3 治疗后 24h、48h：中央可见淡染区，并18华中科技大学硕士学位论文可见红细胞崩解碎片，血管结构难以识别，肿瘤组织内可见淡染区域扩大，并可见核固缩、核溶解。图 4 组 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）治疗后 HE 染色显示肿瘤组织的病理变化注： A ：（ 40）显示细胞排列疏松B：（ 10）显示周围水肿C：（ 4）显示空泡、囊性变D：（ 4）显示核固缩、核溶解五、免疫组化CD31染色及 MVD计数（1）光镜下观察（图5）：组 1 各

45、时间点：肿瘤组织内可见大量微血管，管腔结构完整；组3 治疗后即刻、 1h、24h：微血管密度明显减少，微血管闭合呈线状，肿瘤中央区的微血管结构难以识别；组 3 治疗后 48h：肿瘤周边微血管增多。19华中科技大学硕士学位论文图 5 组 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）治疗后 CD31 染色显示肿瘤组织的微血管注：血管内皮细胞被染成棕色A ：( 10) 微血管密度明显减低 , 闭合呈线状B： (40)微血管结构不完整（2）MVD 计数 (表 6)：治疗后 24h，组 3 的 MVD 值明显低于组 1，差异有显著统计学意义（P0.01）。组 3组 1MVD （?s， %）30.22.65

46、0.23.4P 0.01表 6 组 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）与组 1(对照组 )治疗后 24h 的 MVD 值（? s，%）六、免疫组化Ki-67染色及 Ki-67 标记计数（1）光镜下观察（图6）：治疗后 72h，组 1 与组 3 瘤组织内均可见细胞核中含棕黄色颗粒的阳性细胞，但组3肿瘤组织中部的阳性细胞数明显少于组1。20华中科技大学硕士学位论文图 6 组 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）与组 1（对照组）的 Ki67 染色显示增值细胞（40）注：图中可见细胞核中出现棕黄色颗粒的细胞为Ki67(+) 细胞A ：组 3 的肿瘤组织中阳性细胞稀少B：组 1 的肿瘤组

47、织中阳性细胞较多（2） Ki-67 标记计数（表 7）：治疗后 72h，组 3 的阳性细胞数明显低于组1，差异有显著统计学意义（P0.01）。组 3组 1Ki-67 标记计数（ ?s，%）37.3 4.761.23.6P 0.01表 7 组 3（NB+L-US(1.5w/cm 2)）与组 1（对照组）治疗后 72h 的 Ki67 标记计数（ ?s，%）21华中科技大学硕士学位论文讨论（1）肿瘤血管生成的重要性不单肿瘤的生长需要肿瘤新生血管的形成，肿瘤的转移也离不开血管新生，因此抑制肿瘤生长减少肿瘤细胞转移，使肿瘤缺血、缺氧、凋亡和坏死，需要阻断肿瘤血管的生成。传统的介入治疗主要针对较大的营养血

48、管，对小的滋养血管不能有效栓塞，而且对于散在、多发的肿瘤组织也难通过手术或血管介入栓塞的方式得到治疗；现有的通过药物攻击肿瘤新生血管特异性靶点的方法易引起许多不良反应且很难达到理想效果1 。因此临床上迫切需要一种新的治疗方法来靶向阻断肿瘤新生血管的形成11 。（2）肿瘤血管的特点肿瘤新生血管基底膜明显减少，缺乏血管壁神经和肌肉成分，血管内皮细胞分化程度较差，且多处于细胞增殖期，因此血管通透性明显升高12,13 ，这是肿瘤新生血管与正常组织的成熟血管在结构和功能上的区别。（3）超声微泡抗血管治疗肿瘤的原理由于上述特点，肿瘤血管对空化效应的反应更为敏感，因此超声空化治疗对肿瘤血管更具靶向性 2 。

49、由于微泡作为人为空化核的引入14 ，治疗时间缩短，空化效应增强，尤其是瞬态空化可有效破坏肿瘤血管，并且肿瘤新生血管越丰富，微泡越容易进入肿瘤内积聚，进而引起更强的空化效应。Vaezy 等 15 认为空化效应导致的是组织结构破裂，而不是使组织凝固性坏死。超声破裂微泡抗肿瘤血管的可能原因：一方面直接损伤血管内皮细胞，启动内、外源性凝血，导致微血管血栓形成，阻断血供；同时，微血管周围的水肿、血肿等反应，挤压微血管，进一步减少靶区血供16 ；此外，组织的血流量的减少也造成热疗散热的减少，因而提高热疗的疗效。 但最后一点在低功率超声联合微泡治疗中作用微小。本实验病理结果可见：纳米泡联合超声治疗后，肿瘤细

50、胞排列疏松，血管内皮连续性中断，组织间有大量红细胞渗出，并可见细胞水肿、空泡、囊性变，随着时间的22华中科技大学硕士学位论文推移，并可见核固缩、核溶解，肿瘤组织内可见淡染区域扩大。纳米泡联合超声导致了肿瘤组织结构破坏和坏死。CD31 染色结果可见：相比治疗前，治疗后肿瘤组织微血管密度明显减少，微血管闭合呈线状，肿瘤中央区的微血管结构难以识别，因此纳米泡联合超声能够破坏肿瘤的微血管。CEUS 纳米泡联合超声治疗后即刻， VI 为（ 1.480.29） db，显著低于对照组（ 30.801.56） db，差异有显著统计学意义（ P0.01）。这与其他人的研究相一致。高文宏等 17 采用低频超声辐照

51、微泡，观察其对裸鼠人肝癌HepG2 移植瘤微血管的损伤作用，肉眼可见肿瘤表面出现散在、多发的出血点，光镜下可见肿瘤微血管内皮细胞肿胀、血管壁断裂，组织间隙弥漫性出血、水肿、血肿；肿瘤组织造影的两个血流灌注定量参数曲线下面积和峰值强度百分比均明显下降。Liu 等18 采用低频超声辐照微泡治疗鼠皮下移植瘤，使用声强分别为 0.4 W/cm 2 和 1.36 W/cm2，发现：声强 0.4 W/cm2 时对肿瘤组织的血管破坏程度比 1.36 W/cm2 轻；当声强为 1.36 W/cm 2 时，可完全阻断移植瘤的血供达 24 h，而声强 0.4W/cm2 时，肿瘤微循环只能阻断约1 h ；光镜下可见

52、肿瘤组织微血管内血栓形成、组织间隙水肿、空泡形成，并可见瘤组织的大面积坏死。此外，利用超声空化效应损伤血管壁，也在对其它多种组织的研究中得到证实16 ，19-21 。（4）纳米泡联合超声物理治疗肿瘤的优势前人的研究多集中于超声联合微米级微泡用于肿瘤的治疗，如：Sonovue、脂氟显、白蛋白微泡等，纳米级微泡凭借粒径小、穿透力强、稳定性高22,23 等优势，越来越受到人们的关注，但多用于成像研究、靶向研究、载药性研究方面24,25 ，纳米级微泡联合超声的能否用于肿瘤物理治疗以及是否也有其潜在的优势，正是这次研究的问题。本实验对比相同质量浓度的微米级微泡Sonovue和自制纳米级微泡在同样超声参数

53、下对结肠癌皮下移植瘤的抗血管治疗效果。VI 由 CEUS 血流灌注参数 PI 减去造影剂到来前组织本身的声强度值得到，它反映肿瘤组织的造影增强强度，可以反映肿瘤的血流灌注情况。治疗后即刻两组分别与对照组的VI 比较， VI 均明显下降，差异有显著的统计学意义（P0.01），两者均表现出良好的破坏肿瘤微血管的效果，但各时23华中科技大学硕士学位论文间点两组间 VI 相比，差异无统计学意义。分析其原因如下：超声破裂微泡通过产生机械作用 26 损伤内皮细胞， 根据物理学理论， 单个的微米级微泡其被破坏产生的机械能量大于纳米级微泡， 但是同样质量浓度的纳米级微泡个数远大于微米级微泡，另外，纳米泡的穿透

54、力强，容易穿透血管壁达周围靶细胞，在脉冲超声作用下，不单破坏了血管中的纳米泡损伤了血管壁内皮细胞，也破坏了渗出血管壁外的纳米泡进而直接损伤周围肿瘤细胞，造成的血管外反应可能相对更为严重。因此可能造成了两者的损伤作用无明显差异。另外，与对照组的VI 对比可见： Sonovue+L-US 组：治疗后 24h 肿瘤组织恢复血供； NB+L-US 组：治疗后48h 肿瘤组织恢复血供。相同质量浓度的纳米泡联合低频率超声对肿瘤血供的抑制时间长于Sonovue联合低频超声治疗。排除因样本量小，统计学分析可能存在偏倚的原因外，产生这种结果可能的原因：纳米泡的穿透力强，可穿透血管壁达周围肿瘤细胞，在脉冲超声作用

55、下，通过破坏渗出血管壁外的纳米泡直接损伤血管外的肿瘤细胞，影响了肿瘤细胞缺血促发的各种促血管生长因子的产生。因此，纳米泡联合超声对肿瘤物理治疗时，不光直接破坏血管内皮细胞，同时直接破坏血管壁外肿瘤细胞，从长期效应来看，纳米泡联合超声阻断肿瘤血供持续48h，较相同肿瘤浓度的微米级微泡Sonovue抑制血供时间长。（5）CEUS定量分析参数的价值CD31 抗原广泛分布于肿瘤毛细血管内皮细胞，可使血管内皮细胞标记，因此利用免疫组化CD31 染色能够显示极微小的肿瘤新生血管。评价血管生成的金标准27是 MVD 计数，它利用 CD31 来标记肿瘤血管内皮细胞，因此可反映肿瘤新生血管情况。但存在的问题是，

56、这种病理方法一般只能术后获得，无法对放化疗中或术前的肿瘤的血管生成情况做出实时无创的评价。临床使用的超声造影剂 SonoVue平均粒径 2.5 微米，不能透过血管壁进入组织间隙，为纯血池造影剂， 直接反映肿瘤内的滋养血管和微血管。 利用超声造影分析软件，可以绘制时间 -强度曲线，得到血流灌注参数，如：达峰时间、相对峰值强度、曲线下面积等，来反应病灶血流动力学改变28 ，间接评估肿瘤的MVD 。因此利用Sonovue超声造影并进行 TIC 定量分析是判断肿瘤血管生成情况的良好的影像学方法29 。ROI 包绕整个肿瘤，随时间的变化 ROI 内信号强度的变化反映了微泡浓度的变化,24华中科技大学硕士

57、学位论文微泡浓度的变化进一步反映了组织血流灌注量的变化。因此由造影强度可了解组织的血流灌注情况。治疗后 24h 免疫组化 CD31 染色获得的 MVD 计数在 NB+L-US(1.5w/ cm2)治疗组明显低于对照组， 24hCEUS 获得的 VI 在 NB+L-US(1.5w/cm 2)治疗组也明显低于对照组，都具有显著统计学差异（P0.01）。VI 值能反应肿瘤血供的变化情况，与 MVD 计数表现出一致性。王知力 30 等应用 AcQ 定量分析软件及对比脉冲序列技术，行超声造影检查肝细胞癌患者肿瘤病灶，获得平均峰值强度（ PI）数值，同时行免疫组化分析肝癌组织中 MVD ，发现肝细胞癌的

58、PI 与 MVD 之间呈显著正相关，超声造影的峰值强度可用于评估肿瘤内微血管生成。（6）微泡联合低功率超声物理治疗肿瘤方案的优化从本实验的 CEUS 直观观察和对VI 的统计分析可获知，两种微泡联合超声治疗肿瘤，在治疗后一段时间血供都发生恢复，Sonovue组在 24h，NB 组在 48h，原因可能是随着时间的推移，肿瘤细胞产生各种促血管生成因子促进微血管新生，同时免疫组化也显示 Sonovue组 48h 肿瘤周围区域 MVD 增多。与对照组各时间点的VI 相比较，得出NB+L-US(2.5w/cm 2 )治疗对肿瘤血供的抑制时间达 48h 以上，与 NB+L-US(1.5w/cm 2)治疗组

59、各时间点的 VI 相比，两者在治疗后即刻、治疗后 1h、治疗后 24h 差异有统计学意义（ P0.05）。因此可以通过增大超声功率的方法加强疗效，但也要注意安全问题，本实验中 NB+L-US(2.5w/cm 2 )治疗组中两只裸小鼠实验中死亡，尸检发现移植瘤下方肌肉组织和胸腔肺脏有淤血。因此单纯一次微泡联合低功率超声治疗， 不足以彻底摧毁肿瘤微血管 ,有必要重复治疗 ,或与抗血管生成药物的联合应用。 另外，本研究中曾联合抗血管生成药物恩度观察对肿瘤抗血管治疗的效果，超声破坏纳米泡一次后连用抗肿瘤血管药物恩度一周，行 CEUS 可以发现 VI 较没有联合恩度组显著减低， 由于数据丢失难以展示研究

60、成果，但是超声微泡破坏肿瘤组织现有血管， 联合抗血管生成药物对 EGFR 等因子的抑制作用，确实优化了现有治疗方案。细胞核相关抗原 Ki67 31,32 是增殖性细胞核的标记物， 被用以估计肿瘤细胞的增殖能力。在治疗后 72h 时间点，NB+L-US(1.5w/cm 2 )治疗组的 Ki67 计数明显低于对照组，差异有显著统计学意义（ P0.01）。因此纳米泡联合低频超声治疗肿瘤可以抑制肿瘤细胞增殖。25华中科技大学硕士学位论文（7）本实验的不足之处：样本量小，统计学分析可能存在偏倚；目前计算MVD 采用 1991 年由 Weidner9等提出的方法，客观性稍差，以后尽量寻求使用高级软件精确定