烟曲霉不同菌株致病力差异的研究

1、烟曲霉不同菌株致病力差异的研究【摘要】目的通过挑选出致病力最强和最弱的菌株研究烟曲霉的致病机制。方法SPF级雄性IR小鼠216只，体重(200.5)g。随机分9组，每组8只感染组7组，阴性对照组和正常对照组各1组。其中感染组和阴性对照组小鼠免疫抑制后，分别接种7株烟曲霉的孢子悬液和生理盐水。正常对照组不注射环磷酰胺和孢子悬液。每日观察小鼠的生存状态。对死亡小鼠和处死小鼠的脏器进展组织匀浆菌落计数和病理学检测。实验重复3次。通过比拟生存率、中位生存期、平均体重、组织匀浆菌落计数和组织病理学变化等来比拟烟曲霉的致病力差异。结果感染组小鼠接种孢子悬液后，体重迅速下降。肺组织病理学检测观察到组织坏死，

2、菌丝聚集；肺组织匀浆培养得到的菌株经分子生物学鉴定为烟曲霉。阴性对照组小鼠体重下降速度较感染组慢，无死亡；肺组织病理学检测未见菌丝侵袭。通过比拟生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标，从7株烟曲霉中挑选得到致病力最强和最弱的菌株烟曲霉JL50134和JL30566。结论不同烟曲霉菌株间存在致病力的差异。【关键词】致病力；动物模型；烟曲霉烟曲霉Aspergillusfuigatus感染所致侵袭性肺曲霉病IPA是引起高危患者如中性粒细胞减少症、造血干细胞移植、长期高剂量使用激素和血液恶性肿瘤等免疫力低下患者致死性感染的主要原因。由于IPA的发病率高、病情进展迅速、死亡率高60%90%及缺乏有效的

3、治疗药物12，其相关研究受到了极大关注。目前，烟曲霉的致病机制尚不明确，已往的研究多集中在通过改造单一或几个与致病性相关的基因来研究菌株的致病机制3，而通过比拟不同烟曲霉菌株间致病力差异进展研究在国内尚未见报道。获得致病力不同的菌株，可以全面、系统地分析和比拟与致病力相关的诸多因素，对烟曲霉的致病机制以及治疗药物开发等方面的研究非常必要。本研究将通过评价生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标，比拟7株不同烟曲霉致病力的差异。1材料与方法1.1材料1.2方法1.2.1孢子悬液的制备将烟曲霉接种于PDA斜面培养基上，28培养5d。用含有0.05%吐温80的生理盐水制备一定浓度的孢子悬液。将孢子悬

4、液进展连续稀释后涂布在PDA平板培养基上，28培养3d，进展菌落计数，与涂布的孢子悬液浓度进展比拟，计算孢子活力菌落计数稀释倍数/孢子悬液浓度90%可进展接种5。1.2.2接种浓度确实定配制烟曲霉JL50134的孢子悬液浓度：1.01031.0109FU/l共7个梯度感染小鼠，每个浓度10只，预计选用3d内导致50%小鼠死亡的孢子悬液浓度作为实验接种浓度5。1.2.3动物的免疫抑制和分组随机挑选小鼠216只，分9组感染组7组，阴性对照组和正常对照组各1组，每组8只。饲养于IV鼠笼中，室温2426，保持湿度，日照14h和黑夜10h交替进展，垫料、食物和水灭菌处理。饮水中参加四环素1g/l防止细菌

5、感染，实验过程中不限食水。感染组和阴性对照组第1、4天腹腔注射环磷酰胺150g/kg进展免疫抑制5，第5天尾静脉采血计数外周血白细胞数量，通过白细胞减少的程度确定小鼠是否受到免疫抑制。1.2.4实验动物的接种小鼠通过吸入乙醚麻醉，使其昏迷超过1in，抑制吞咽反射。取30l不同浓度或不同菌株的烟曲霉孢子悬液孢子活力90%滴入一侧鼻孔；阴性对照组小鼠进展同样麻醉，接种等量的含有0.05%吐温80的生理盐水；正常对照组小鼠不注射孢子悬液和生理盐水。1.2.5动物感染过程监测、脏器处理及感染菌株鉴定感染后15d内，每日观察小鼠的生存状态，测量体重，计算生存率；取感染死亡小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏进展

6、组织匀浆，稀释至浓度为1.010-3g/l。取200l涂布在PDA平板培养基上，28培养3d，进展菌落计数。将脏器剩余局部用10%v/v甲醛固定，浸入石蜡，切片，HE染色。15d后，将仍然存活的小鼠颈椎脱臼法处死，处死小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏的操作同前。将组织匀浆培养得到的菌株，利用小琼脂块培养法进展初步鉴定。提取菌株DNA，利用真菌通用引物(E14和rE24)扩增线粒体细胞色素b基因片段6，并进展DNA序列测定。将测定结果与GenBank中烟曲霉序列进展比对，以验证该菌株是否为烟曲霉。以上实验重复3次。1.2.6烟曲霉致病力的比拟通过综合分析生存率、中位生存期、平均体重、肺组织匀浆的菌落

7、计数及其组织病理学变化来比拟7株烟曲霉的致病力。2结果2.1接种浓度确实定接种烟曲霉JL50134共7个浓度的孢子悬液，生存率计算结果见表1。发现浓度为1.0107FU/l时，在第3天50%的小鼠死亡，确定该浓度为实验接种浓度。表1烟曲霉不同浓度孢子感染小鼠生存率(略)转贴于论文联盟.ll.2.2小鼠的生存状态注射环磷酰胺前，小鼠外周血白细胞计数为7.20.23109FU/l，注射环磷酰胺后第5天，小鼠外周血白细胞计数为1.50.45109FU/l，证实小鼠处于免疫抑制状态7。感染组小鼠接种孢子悬液23d后，可见活动减少；78d后表现为消瘦、体重急速下降，甚至死亡。阴性对照组小鼠接种等量生理盐

8、水12d内，活动减少，体重稍有下降，2d后逐渐恢复正常，无死亡。正常对照组小鼠活动良好，体重上升。2.3小鼠生存率比拟2.4小鼠平均体重比拟7组小鼠感染后平均体重均开场下降，JL50134感染小鼠平均体重下降的幅度和速度最大，第34天1d内小鼠平均体重下降约8.0g，此后全部小鼠死亡。说明该菌感染造成的病理损害非常严重和迅速。JL30566感染小鼠的平均体重下降的幅度和速度最小，在第56天时下降约3.6g，第7天后逐渐停顿下降，随后稍有上升。说明该菌感染造成的病理损害相对较轻。其他5组的变化介于上述两者之间，下降幅度最大者1d内约为4.9g。阴性对照组仅在接种生理盐水后的5d内平均体重下降，随

9、后逐渐上升，在第9天后逐渐恢复至接种前程度，并不断上升。见图2。2.5小鼠的组织匀浆培养和菌落计数将小鼠肝脏、脾脏、肾脏和肺脏的组织匀浆涂布在培养基上，28培养23d。除肺脏出现白色绒毛样丝状真菌菌落外，其他脏器均未见有菌生长。3d后菌落呈深绿色粉末状，反面淡黄褐色。经小琼脂块培养、乳酸酚棉兰染色，显微镜下可见多呈45角分支的分生孢子梗，烧瓶状的顶囊，单层小梗位于顶囊上半部，小梗上可见链状排列的球形分生孢子。结合菌落特征和显微镜下形态学特点，初步鉴定为烟曲霉。计数7株菌感染小鼠肺组织匀浆的菌落数量，以Lg(FU/gra)表示，结果见表2。培养至第3天，阴性对照组和正常对照组组织匀浆无菌生长。7

10、个感染组的组织匀浆菌落计数Lg值在2.99540.0341之间，组间差异无统计学意义(P0.05)，说明7组间小鼠肺组织匀浆培养得到的菌量一致。表27株烟曲霉感染小鼠肺组织匀浆菌落计数略2.6菌株的分子生物学鉴定利用真菌通用引物扩增得到约420bp的线粒体细胞色素b基因片段，见图3。经过DNA序列测定以及序列比对，证实肺组织中别离得到的菌株是烟曲霉。2.7小鼠的肺脏组织病理学观察感染组小鼠肺脏组织切片可见致密、有隔、宽度均一36的菌丝，放射状或片状生长。分生孢子梗多呈45角分支，有时可见菌丝侵入血管，伴有肺组织的充血、出血和炎症细胞浸润。烟曲霉JL50134和JL30566感染小鼠的组织病理学

11、变化见图4。结果显示，JL50134感染小鼠肺组织有出血和充血，大量孢子萌发成菌丝体箭头所示，聚集在血管周围并侵入组织，造成肺泡壁的破坏、炎症细胞浸润图4a。JL30566感染小鼠可见肺组织构造较为完好，仅有少量出血和炎症细胞浸润图4b。通过比拟7株烟曲霉感染小鼠的生存率、平均体重、组织病理学变化等指标，挑选出了致病力最强的菌株JL50134和最弱的菌株JL30566。3讨论烟曲霉是一种腐生菌，在环境中分布广泛，且其分生孢子体积微小，极易被人体吸入。假设吸入肺泡中的烟曲霉分生孢子逃过宿主的免疫防御系统，就会萌发产生菌丝，侵入肺组织并血行播散至全身引起感染。由于烟曲霉常进犯免疫力低下的患者，因此

12、选用环磷酰胺腹腔注射造成免疫抑制状态，以进步小鼠对烟曲霉的敏感性。鉴于烟曲霉造成的IPA多为分生孢子经鼻腔吸入肺内所致8，因此本研究选择鼻腔接种法进展感染，相比气管内接种更加简便快速，对小鼠的伤害较少，能更真实的模拟感染过程，并可防止感染过程中小鼠的意外死亡；此外，该方法容易定量，便于比拟不同菌株间致病力的差异。本研究发现，烟曲霉JL50134感染小鼠后，生存率下降最快，造成的病理损害最为严重，而烟曲霉JL30566感染小鼠后，生存率下降较慢，病理损害较轻。说明JL50134和JL30566在致病力上存在显著差异，认为分别是致病力最强和最弱的菌株。目前认为烟曲霉致病机制与很多因素相关，研究说明虽然宿主呼吸道内的纤毛可以有效地去除一些分生孢子，但是真菌分生孢子侵入宿主肺泡内，黏附于肺泡基底膜是感染的第一步9。同时机体的肺泡巨噬