CF荧光定量PCR仪操作指南(Bio-rad)

1、(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)CFX96CFX96 实时荧光定量 PCR 仪操作流程及留意事项开头运行仪器翻开电脑翻开定量 PCRCFX Manager放置样品将 PCR 反响体系参加到 0.2ml 低缘八联管,盖上管盖;或参加低缘 96 孔板,用光学级封膜封好。留意,必需带一次性塑料手套,不要让手指接触到反响管外表。将反响管按挨次放入仪器的加热孔中.设置程序，运行试验PCRa。 设置热循环程序文件(Protocol Tab b。设置反响板文件(Plate Tab. C.点击“Start Run”键，运行程序热循环程序文件Protocol Tab设置指南：点击 Edit编辑或

2、 Create New创立程序.反响板设置文件Plate Tab设置指南：选择本次试验所要使用的荧光染料种类;单击样品类型;如要某些反响孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品(Standard,点击“DilutionSeries”键可设置其标准品浓度及稀释倍数。点击“Start Runopen lidClose lid关闭热盖Start Run，保存文件，开头运行程序。结果分析PCRCt点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单关闭运行仪器试验完毕后取出反响管，挨次关闭 CFX Manager 软件、定量 PCR 仪电源，关闭电脑。留意！CFX 仪器上盖局部为全自动把握，在通电状态，严禁

3、任何人为干预上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager试验操作程序设置图 1 显示试验设置窗口中一个预览的程序。点击 CreateNew，翻开程序编辑器创立一个的程序。点击 SelectExisting，通过扫瞄器加载一个程序或对其进展编辑。使用 Express Load Edit Selected,翻开程序编辑器编辑所选程序的各个步骤。点击 Start Run开头运行当前加载的程序。程序编辑器程序编辑器可用来创立一个程序或编辑一个已存在的程序，图 2。1在图形或文本模式下选择任何需要编辑的一步(该步骤会用

4、蓝色高亮显示)，点击温度或保持时间进展直接编辑。 2点击 Insert Step在程序中增加一个温度步骤。点击 Delete Step在程序中删除选中的步骤.(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)点击 Add Plate Read to Step,在程序中指定猎取荧光数据的时间。假设当前的高亮显示步骤已经进展了读板设置，则这一选项变为 RemovePlateRead.假设在这一步不想猎取数据，则点击 RemovePlateRead.点击 GOTO 步骤的重复次数，转变程序中的循环次数，图 2 第 4 步。点击 GOTO 步骤数可转变 GOTO的步骤.增加一个梯度步骤：在程序编辑把握窗

5、口中，点击 Insert Gradient,图 2.对梯度中最低和最高温度值进展编辑,在图形模式，文本模式下或消灭在文本模式右侧的梯度范围计算器中直接点 击数值进展编辑，图 3.在梯度范围计算器中，对任何一行都可以赐予一个指定的温度.每行的温度都会调整为适宜的温度来满足指定的温 度范围。增加熔解曲线：1在程序编辑把握窗口中，点击 Insert Melt Curve ，图 2。2在图形或文本显示模式下，点击温度值来编辑融解曲线范围的最低和最高温度，图 4 第 5 步。(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)点击增量值来编辑数据猎取的温度区间。点击保持时间编辑每一个增量温度的保持时间。(完

6、整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager定量分析数据扫瞄扩增图表可以显示试验中每个循环每个孔收集的相对荧光信号曲线。点击位于扩增图表下方的荧光检查窗，选择需要11。选中的孔是蓝色的，未选中的孔是亮数据分析选项 CFXManager Settings Threshold 可以转变基线范围。软件会自动计算基线的位置。可以点击并拖动阀值线来手动定位.点击工具栏中 View/Edit Plate按钮来编辑孔的内容，可以临时创立的分群，从分析中增加或删掉一些孔。图表选项可用鼠标右键点击任何图表来复制或保存图像，或选择 Chart Options 来转变轴范围或删除栅格,图 2.

7、点击工具栏中 Trace Styles 按钮，或鼠标右键点击任何图表来设定制定孔的荧光信号曲线颜色。鼠标左键点击任何图表,向下(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)和拖动光标可以放大图表。孔的分群数据扫瞄使用工具栏中 Select Well Group 下拉菜单来扫瞄指定孔的分群数据，图 3.软件可以针对每个分群作为独立的试验来处理,每一个分群可针对自己的设置进展分析，如进展自身标准曲线的分析。定量数据分析显示选项点击数据分析窗口中 Quantitation Data，扫瞄数据计算和统计，包括每个孔的阀值 CT 和平均值以及复制的标准偏差，图 4。点击任一列的标题进展基于列的行分类。

8、鼠标右键点击电子表格并选择 Sort 可进展基于多个列的行分类。鼠标左键点击任一列的标题并向左或向右拖动可以重排列电子表格中列的挨次。鼠标右键点击电子 表格,选择数据输出格式如 text，XML 或 Excel 输出数据,图 4。从 Quantitation Data 下拉菜单中选择 Plate，在反响板栅格模式下显示所选荧光的孔数据.创立报告显示选项点击数据分析窗口工具栏中 Report 按钮,图 1,翻开 Report 窗口，图 5。点击报告选项列表中的检查窗，使制定信息包含5 File并选择 SavePDF格式保存报告,或选择Print打印报告.也可以保存报告为其它的文件格式.(完整)C

9、FX 荧光定量PCR(Bio-rad)CFX Manager通过严谨的质量把握,您可以使用 Gene Expression Module of CFX Manager 软件来评估样品之间靶标浓度的相对差异。这种应用最常用的使用是评估 cDNA 样品中靶标的浓度来推断其 mRNA 水平。通常，一个或多个参照基因的含量被用来衡量目标基因的水平。参照基因用来校正上样的差异或各样品取样的差异。通过生物学条件的争辩，参照基因的表达水平通常不 发生变化.基因表达分析设置图 1 显示各样品孔含单一的荧光，四个复制类群，包含两个不同靶标名称和两个不同的样品名称。指定参照基因点击反响板编辑器中 Experime

10、nt Settings 或 Gene Expression Module,翻开试验设置窗口,图 2.选择 Targets。3点击适宜的检查窗选择将被使用为参照基因的靶标。点击 Show Analysis Settings 检查窗，为靶标设置反响扩增效率。Auto Efficiency 检查窗被默认设定.假照试验中运行一个标准曲线，从标准曲线中计算得到的扩增效率将在计算中被使用.或者对适宜的靶标输入指定反响扩增效率值,则计算中将使用这一扩增效率值。指定比照样本(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)在 Experiment Settings窗口，选择 Samples标签。31，同时全部其

11、他样本相对于比照样本的值会被显示出来.从 Mode4：a.NormalizedExpression Ct-靶标基因的相对量可通过样本的参照基因来进展相对量的衡量.(完整)CFX 荧光定量PCR(Bio-rad)b。相对量Ct-靶标基因的相对量不能被衡量；结果显示的是试验中靶标基因相对于其他样品的基因浓度.图形选项Graph Data Graph Data 选项默认是比照相关。X 轴下拉菜单中选择 X 轴以 Sample 显示或 TargetY 轴下拉菜单中选择 Linear,Log2 或 Log10 作为 YScaling Option下拉菜单中选择 Highest,Lowest 或 Unscaled。Error Type下拉菜单