免疫组织化学的原理及应用2010课件

1、免疫组织化学的原理 及应用 孙勤暖组织化学概念: = 细胞化学 是运用物理、化学、免疫学和分子生物学等原理，对组织与细胞化学成分或酶活性进行定性、定位和定量的研究的科学。传统组织化学概念： 是运用物理、化学 免疫学、电镜技术和分子生物学技术的发展 免疫组织化学、免疫电镜组织化学、原位杂交技术等广义组织化学包括： 传统组织化学、 免疫组织化学、 电镜组织化学、 免疫电镜组织化学、 原位杂交组织化学等生物化学与组织化学区别：生物化学： 1、运用化学原理分析细胞的组成成分以及这些成分在生命过程中的化学反应。 2、生物化学将组织细胞制成匀浆研究（结构被破坏） 3、生物化学的化学反应在试管内或容器内 4

2、、生物化学的化学反应结果观察不用显微镜 5、产物需要分离、提纯组织化学： 运用化学反应原理在组织细胞内对组织细胞化学成分进行定性、定位和定量的研究。产物多需要显色剂显示。如：利用酶的特性一、免疫组织化学技术的基本原理： 免疫组织化学技术是利用抗原与抗体能特异性结合的基本特点，通过显示剂的显示,确定某些抗原或抗体的有无或其存在的位置，来研究某事物的特性。二、组织化学与免疫组织化学技术的区别 组织化学技术： （HE 特殊染色） 通过应用某些能与组织、细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位的显示组织、细胞的特殊化学成分的一门技术。 优点：既保存原有的形态改变又显示特殊化学成分达到形态、功能与代谢相结

3、合。 （不敏感）二、组织化学与免疫组织化学技术的区别 免疫组织化学技术： 将抗原、抗体反应的特异性与组织化学反应的可见性结合在一起，形成了免疫组织化学技术。 优点： 1、形态、功能与代谢相结合（微量） 2、检测的成分更加广泛、敏感、特异性更强四、免疫组织化学技术的优点1、特异性强2、敏感性高3、定位准确4、形态、功能与代谢相结合（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体 Ag Ab-HRP. 底物-显色剂显色（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP（一）直接法:酶标法（一步法

4、） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP AgAb-HRP（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP 底物-显色剂显色 AgAb-HRP（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP 底物-显色剂显色 AgAb-HRP底物-显色剂显色 需要标记所有抗体（二）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，. Ag Ab1 Ab2-HRP 底物-显色剂显色 二步法, 应用范围广; 不需标记一抗,只需标记几个种属的二抗即可（二

5、）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ag-Ab1 （二）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ab2-HRP 底物-显色剂显色 Ag-Ab1 -Ab2-HRP -底物-显色剂显色 二步法, 应用范围广; 不需标记一抗,只需标记几个种属的二抗即可 Envision System 是将二抗 和 HRP 通过一个多聚葡聚糖骨架连接成一个多聚体，多聚体中没有生物素参与，所以它不受内源性生物素的影响，使背景染色降低。特点：敏感、省时、方便、背景低（三）三步法:将酶（HRP）标记在复合物上 1、PAP法 （三）三步法:将酶（HRP）标记在复合物上 1

6、、PAP法 2、ABC法 （三）三步法:将酶（HRP）标记在复合物上 1、PAP法 2、ABC法 3、S-P法链霉菌抗生物素蛋白抗原一抗二抗生物素酶组织组织生物素生物素卵白素卵白素链霉菌抗生物素蛋白4、 四步法、五步法 5、多重标记: 在同一组织或细胞上显示两种以上抗原。 SP法 ABC法 48倍 SP法 PAP法 2550倍 组织标本的取材固定一、取材：二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、 捞片、烤片、脱蜡、水化三、玻片处理：防脱片胶 APES Poly-L-Lysin四、抗原修复化学法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、链霉蛋白 酶、尿素等物理法：单纯加热、高压加热、微波加热 10分钟 90120

7、秒 10分钟 组 织Ab固定液PH值 3.05.07.08.010抗原修复液PH值6.0皮肤AE1/AE3-胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+7.0皮肤AE1/AE3-胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+8.0皮肤AE1/AE3+胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+EDTA 8.0皮肤AE1/AE3+胃粘膜EMA+子宫肌瘤SMA+乳腺癌ER+ 免疫组化染色步骤：（一）S-P法染色步骤:1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4) 冲洗三次,每次三分钟（33）。2、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应 的修复。3、每张切片滴加一滴或50l 3%H2O2 （试剂 A） ，

8、室温下孵育10分钟，以阻断 内源性过氧化物酶。4、 PBS冲洗（33 ）5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l 的非免疫动物血清（试剂 B），室温下孵 育10分钟。6、甩取血清，每张切片滴加一滴或50l第一 抗体，室温下孵育60分钟或4C过夜。7、PBS冲洗（35 ）8、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l 的第二抗体（试剂 C） ，室温下孵育、 10分钟9、 PBS冲洗（33 ）10、甩取PBS液，每张切片滴加一滴50l 的链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液 （试剂 D） ，室温下孵育10分钟。11、 PBS冲洗（33 ）12、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100l 的DAB或AEC显色液

9、，显微镜下观察 3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。 13、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCL 分化0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。 14、如果用DAB显色，则切片通过梯度酒 精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能用酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。 如果组织内源性生物素含量高或由于热修复造成内源性生物暴露，可在加3%H2O2之前，用内源性生物素阻断剂加以阻断之后继续免疫组化染色。（二）Envision法染色步骤:1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4) 冲洗三次,每次三分钟（33 ）。2、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应 的修复。3、每张切片滴加一滴或

10、50l 3%H2O2 室温 下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。4、 PBS冲洗（33 ）5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l 第一抗体，室温下孵育60分钟或4C过夜。 6、 PBS冲洗（35 ）7、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l聚 合物增强剂（试剂 A） ，室温下孵育20分 钟。8、 PBS冲洗（33 ）9、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l酶 标抗鼠兔聚合物， （试剂 B）室温下孵 育30分钟。 10、PBS冲洗（33 ）11、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100l 的DAB或AEC色液，显微镜下观察 3-10分钟阳性显色为棕色或红色。12、自来水冲洗，苏木素复染，0

11、.1%HCL 分化0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。 13、如果用DAB显色，则切片通过梯度酒 精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固； 如果用AEC显色，则切片不能用酒 精脱水，而直接用水性封片剂封片。 免疫组化在肿瘤研究中的应用 1、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类型。 通过检测细胞骨架抗原（如CK, Vimetin, Desmin, GFAP等）;细胞功能产物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE, CgA等）;细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如LCA, EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如CEA, AFP).确定肿瘤来源 胰腺腺泡细胞癌：CK8+、CK18+导管分化癌：CK7+、CK19+

12、甲状腺及滤泡旁细胞 甲状腺滤泡上皮癌 髓样癌 1、Tg + 2、TTF-1 + + 3、 Syn + 4、 Cg-A + 5、Calcitonin + 6、CEA 少+ 多+ 乳头状癌 正常 CK高 + Galectin/HBME-1 + CK19 + + Vimitin + S-100 + P53 + MC + CD56 + 甲状旁腺 PTH + （甲状旁腺激素） Syn+、 Cg-A+、 CK8+、CK18+、CK19+ Ki-675注意复查 类癌、不典型类癌、小细胞癌TTF-1 +/- +Ki-67 4050 60 80CD57 + + + SYN + + + CgA + + +NSE

13、+ + + 免疫组化在肿瘤研究中的应用 1、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类 型。 通过检测细胞骨架抗原（如CK, Vimetin, Desmin, GFAP等）;细胞功能产物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE, CgA等）;细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如LCA, EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如CEA, AFP).确定肿瘤来源 2、某些激素受体及生长因子的检测可判断预后。 如：PR、ER 、 免疫组化在肿瘤研究中的应用 3、癌基因蛋白的研究，研究肿瘤的发生、发展 过程，如各种癌基因、抑癌基因及其相关因素。 P53: 恶变 Bcl-2：淋巴结生发中心反应性和淋巴瘤的区别 Ce

14、r-b-B-2： 乳腺导管内上皮的重度非典型增生和 乳腺导管内癌的区别 4、评价肿瘤增殖活性，对肿瘤分化、复发 提供参考。如ki-67, PCNA等。 5、检测肿瘤组织的转移潜能，如nm23-H, CD44V6, MMP等。6、协助判定肿瘤的分期 LN和型可显示有无浸润7、提高微小癌灶的发现率8、指导肿瘤的治疗 PR、ER、Cer-b-B-2和许多耐药基因的检测9、免疫性疾病的辅助诊断10、病原生物的检查 如：HPV、EB、HP等 免疫组化染色的注意事项：（一）抗体的保存和配制1、保存： 浓缩抗体： -20-40C 约12年 即用型抗体；4C 约1年2、抗体的配制： 浓缩抗体必须找抗体的最佳稀

15、释度 即用型抗体直接使用（二）正确设计对照 阴性对照（PBS或非免疫血清）、阳性对照（购置的或自己收集的）、自身对照、抑制对照和吸收对照。 抑制对照和吸收对照一般不用。（三）出现假阳性的几种常见原因1、抗体稀释度不够，浓度太高。2、抗体与多种抗原有交叉反应。3、抗体与组织中某些成分非特异性结合， 出现异常表达，如：S-100在鳞状上皮表达。4、内源性酶的显色5、肿瘤与病变组织中有其他组织残留 （尤其是肿瘤中有正常组织残留）6、抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原 在不该出现的部位出现。7、异位抗原的表达，（有人认为是交叉 免疫反应）8、内源性生物素的影响。表2：生物素在正常组织中的分布情况组织生物

16、素组织生物素组织生物素舌鳞状上皮-喉黏膜腺管+/1卵巢间质-舌横纹肌-支气管上皮+/3卵巢颗粒细胞+/2食道鳞状上皮-支气管腺体+/2乳腺小叶、导管+/3胃上皮-肺泡-乳头鳞状上皮-胃腺体+/3肾脏近曲管+/3脑胶质-十二指肠平滑肌-肾脏远曲管+/3神经元+/312指肠上皮腺体+/3肾小球-神经纤维-小肠上皮+/2肾集合管+/3甲状腺腺泡+/2小肠上皮、腺体+/2肾盂移行上皮+/3甲状腺C细胞+/3阑尾上皮、腺体+/3膀胱+/2甲旁腺嗜酸细胞+/3结肠上皮、腺体+/3前列腺+/3肾上腺皮质+/3直肠上皮、腺体+/3尿道上皮+/3肾上腺髓质-肛门鳞状上皮-睾丸曲细精管+/3胃内分泌细胞+/3腮腺

17、导管+/3附睾支持细胞+/2睾丸间质细胞+/3腮腺腺泡-输精管上皮+/2胰岛-颌下腺导管+/3宫颈鳞状上皮-淋巴结-颌下腺腺泡-宫颈柱状上皮-扁桃体-胰腺腺泡-宫颈腺上皮+/2脾-胰腺导管+/3增殖期内膜腺体+/2浆细胞+/3肝细胞+/3分泌期内膜腺体+/3皮肤鳞状上皮底层+/3胆管+/2蜕膜腺体+/2皮脂腺+/3胆囊+/3蜕膜细胞+/3脂肪细胞+/3鼻黏膜上皮+/2胎盘绒毛+/2平滑肌-鼻黏膜腺体+/2脐带-横纹肌-会厌黏膜-输卵管+/1心肌+/3血管-注：- 阴性；+/1 弱阳性点状分布；+/2 中度阳性片状分布；+/3 强阳性弥漫分布。HE未修复修复修复+封闭修复+DAB标准CK生物素生

18、物素标准CK生物素+CK胃内分泌细胞皮脂腺垂体腺瘤腺淋巴瘤大鼠肾脏大鼠肝脏大鼠胰腺研究显示 （1）冰冻组织中存在内源性生物素。（2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。（3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。（4）内源性生物素暴露的强度各不相同，从弱阳性（+） 到强阳性（+）。（5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布 也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。（6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺 上皮组织，亦存在部分非上皮组织。（7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。（8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增 加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA

19、。（9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。建议 为了避免免疫组化中内源性生物素的干扰，凡采用冰冻切片或石蜡切片加热抗原修复用非生物素检测系统：1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。可采用蛋清或 卵白素作为封闭剂。2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。3、应坚持使用阴性对照。（四）出现假阴性的几常见种原因1、抗体和检测试剂盒配对不合理（现在一 般用通用型可避免试剂盒配对不合理）2、抗体的浓度太低3、孵育的时间太短（根据要求做）4、固定和温度 有的抗体不适合用于福尔马林固定的组织，仅适合用于冰冻切片；固定、包埋的温度过高，抗原丢失（62C）5、染色步骤不正确6、染色过程中切片

20、过分干燥（五）出现背景着色的几种常见原因1、内源性的过氧化物酶没有阻断2、正常动物血清使用不合理（如二抗为羊抗鼠的 IgG ,因该用羊的血清)。3、脱蜡不够彻底4、组织粘贴剂使用不当或太浓5、PBS冲洗不够6、抗体稀释不合理，浓度太高。7、底物显色时间太长（六）显示剂的合理使用和增强方法1、显示剂：目前最常用的 DAB 和 AEC 仅用于HRP系统 AP-Red 和 Fast-Blue 仅用于AP系统2、增强剂：主要是在DAB显色加一些金 属离子。如：镍、铜、钴等（七）结果判定标准1、阳性细胞定位是否明确（膜、浆、核）2、间质是否清晰3、有无背景着色 4、根据不同的情况判定阳性的标准 （有的阳

21、性细胞数在5%以上才定为阳性）5、注意抗原的联合表达如：分化差的癌可表达间叶的成分（七）免疫组织化学染色中常见脱片原因1、组织固定、脱水、透明不充分。2、组织切片过厚。3、组织切片有折叠。4、过度的热抗原修复（高压、微波、水煮）处理或抗原修复液的pH偏高。5、操作过程中，冲洗方法不正确等。G. 结果判断背景干净, 位置正确Dako, c-kit, malignant mesotheliomaDako, c-kit, malignant mesotheliomaDako, c-kit, malignant mesotheliomaDako, c-kit, malignant mesothelio

22、maDako, c-kit, GISTP16, anorectal SCCP16, anorectal SCC P16, anorectal SCCBreast lobular carcinoma in thyroid gland, TG一. 免疫组化报告取材 封片 观察 （共10分） 一块已知的食管鳞状细胞癌组 织，周围带有少量的正常的食管组 织，让你用免疫组化Envision法、 用第一抗体为鼠抗人的单克隆抗体 CKAE1/AE3以检测该食管鳞状细胞 癌的组织情况,你如何做出一张 合格的免疫组化切片? 要求：1、实验目的 ：2、实验方法：3、使用的实验设备和药品：4、实验步骤：5、实验结果

23、：二、免疫组织化学染色切片 （10分） 谢 谢免疫组织化学试题一. 免疫组化报告取材 封片 观察 （共15分） 一块已知的肺鳞状细胞癌组 织，周围带有少量的正常的肺组 织，让你用免疫组化Envision法、 用第一抗体为鼠抗人的单克隆抗体 CKAE1/AE3以检测该肺鳞状细胞 癌的组织情况,你如何做出一张 合格的免疫组化切片? 要求：1、实验目的 ：2、实验方法：3、使用的实验设备和药品：4、实验步骤：5、实验结果：二、免疫组织化学染色切片 （10分）免疫组织化学试题一. 免疫组化报告取材 封片 观察 （共15分） 一块已知的肺鳞状细胞癌组 织，周围带有少量的正常的肺组 织，让你用免疫组化En

24、vision法、 用第一抗体为鼠抗人的单克隆抗体 CKAE1/AE3以检测该肺鳞状细胞 癌的组织情况,你如何做出一张 合格的免疫组化切片? 要求：1、实验目的 ：2、实验方法：3、使用的实验设备和药品：4、实验步骤：5、实验结果：二、免疫组织化学染色切片 （10分）组织组织组织组织抗原一抗生物素二抗生物素卵白素酶组织组织生物素生物素卵白素卵白素表2：生物素在正常组织中的分布情况组织生物素组织生物素组织生物素舌鳞状上皮-喉黏膜腺管+/1卵巢间质-舌横纹肌-支气管上皮+/3卵巢颗粒细胞+/2食道鳞状上皮-支气管腺体+/2乳腺小叶、导管+/3胃上皮-肺泡-乳头鳞状上皮-胃腺体+/3肾脏近曲管+/3脑胶质-十二指肠平滑肌-肾脏远曲管+/3神经元+/312指肠上皮腺体+/3肾小球-神经纤维-小肠上皮+/2肾集合管+/3甲状腺腺泡+/2小肠上皮、腺体+/2肾盂移行上皮+/3甲状腺C细胞+/3阑尾上皮、腺体+/3膀胱+/2甲旁腺嗜酸细胞+/3结肠上皮、腺体+