【生物医学】治疗性血管新生实验研究的若干进展-复旦大学上海医学院生理与病理生理学系金惠铭教授

1、治疗性血管新生实验研究的假设干进展金 惠 铭复旦大学上海医学院生理与病理生理学系 上海 200032，中国治疗性血管新生实验研究的假设干进展治疗性血管新生的概念及现况血管新生旁观分子对内皮细胞增殖的影响生长因子对内皮细胞迁移的双相调节三. 内皮细胞生长因子受体活性的动态变化四. 血管内皮祖细胞 治疗性血管新生的 概念及现况Therapeutic Angiogenesis治疗性血管新生 将外源性血管新生诱导因子导入缺血组织，增强缺血区毛细血管新生，从而加速侧枝循环的形成。 主要用于治疗缺血性(心血管)疾病。Folkman, J 肌肉注射 局部灌注A.V.滴注 渗透泵心腔外注入 病毒载体介导 局部

2、注射 基因埋线 基因治疗 脂质介导 球囊导管导入 转化细胞包被应用 质粒DNA介导 冠脉内支架 蛋白治疗VEGF治疗细胞治疗治疗性血管新生常用的方法细胞铺路Cellular Spreading分子搭桥Molecular Bridging Folkman JFrom the lab to the clinic: one investigators journeyJ Law, Medicine & Ethics 2002, 30(3): 361366从实验室到临床:一位科学家的旅行一.血管新生旁观分子对内皮细胞增殖的影响Bystander molecules(血管新生) 旁观分子COX-2，PGE

3、2，Integrins，etc.bEnd.3 (200 )经典途径bFGF-induced proliferation of bEnd.3 (MTT) -actinEffect of bFGF on COX-2 protein expression in bEnd.3 (Western Blot)COX-2 0 4 8 16 32 Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)Control bFGFEffect of bFGF(10ng/ml) on COX2 protein expression in bEnd.3 (8h,ABCmethod,400X) GAP

4、DH COX-1 COX-20 1 2 3 6 12 Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)Effect of bFGF on COX mRNA expression in bEnd.3 (RT-PCR) bFGF-induced PGE2 secretion of bEnd.3 & effect of COX-2 inhibitor on it (ELISA)Effects of COX-2 inhibitor and PGE2R antagonist on bFGF-induced VEGF secretion in bEnd.3bFGFEC增殖VEGF

5、COX-2PGE2bFGF引起EC多途径增殖经典途径 旁路 途 径 信号转换bFGF非特异性 EC特异性VEGF二.生长因子对内皮细胞迁移的双相调节EC划痕损伤模型EC scratch wound model 研究: 细胞迁移 ( cell migration) Dynamic changes of cell migration induced by bFGF in cultured bEnd.3 Left: bFGF (5g/L) Center: control Right: bFGF (15 g/L)0h24h48h内皮细胞体外划痕损伤模型中bFGF对细胞迁移的影响Focal Adhesi

6、on Kinase粘着斑激酶FAKFAKNBand 4.1Kinase DomainFGFCPhosphorylation FAK Tyr-397F.A.TY397Activitied FAKPGrowth Factor Receptor PTKsPro-1Pro-2FAKRasRafMEKERKCrkSOSSrcPaxillinCASGrb2PWAVE/ScarDOCK180RacPakASAGRAFMigrationGTPaseFAK含量051015(g/L)bFGF对血管内皮细胞中FAK含量的影响 (Western Blot, 12h)bFGF*P0.05*FAK活性 051015(g/

7、ml)bFGF对血管内皮细胞中FAK活性的影响 (12h)* P0.050h6h12h510bp(FAK)510bp(FAK)510bp(FAK)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)og./L bFGF 2. 5g/L 3. 10g/L 4. 15g/L bFGF对FAK mRNA表达的影响(RT-PCR)内皮细胞生长因子受体活性的动态变化三.VEGF受体(Flk-1)在心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细胞上的表达 (免疫组化，ABC法 400)A. 梗死区 B. 梗死边缘 C. 非梗死区 D. 对照心肌ABCDExpression changes of bFGF

8、R1 after rat acute myocardial infarction (Real-time RT-PCR, n=5)*#*#*#*#*#*#*/GEArrayTM Q series Mouse Angiogenesis Gene Array小鼠血管新生基因芯片(Super Array, U.S.A.)非梗死区边缘区心肌梗死大鼠心肌细胞内血管新生基因表达的变化 (Micro-array)心肌梗死大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生诱导因子受体基因表达的变化 (1W)PositionGenebankGene nameControlExperiment14NM_010109Ephrin A r

9、eceptor1.474E-12.170E-217NM_007912EGFR-0.000E-1-0.000E-129M33760FGFR10.004E-12.773E-430M81342FGFR38.731E-39.014E-431NM_008011FGFR42.816E+03.077E+033X59397Flk-1/KDR1.199E+01.049E+034L07297Flt-1-0.000E-12.773E-359NM_011058pDGFR-0.000E-12.982E-360NM_008809pDGFR-0.000E-15.055E-276D13738Tie-2-0.000E-19.0

10、14E-481D28526TGFR1-0.000E-10.000E+082NM_009371TGFR22.834E-11.907E-2四.血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cell)磁性活化细胞分选系统Magnetic activated Cell-sorting system (MACS) MicroBeads: 50nm 用MACS 别离脐血中CD133+ 细胞模式图经磁珠别离的CD133+细胞培养14d后细胞外表分子标志CD133流式细胞仪鉴定结果 (A:0d B:14d)ABDecrease of cell markers CD133, CD34 on ad

11、herent cells and increase of Flk-1 in the presence of VEGF, bFGF and SCF after 14 days of culture (P0.05).干细胞血管内皮祖细胞造血干细胞内皮祖细胞，内皮细胞，造血干细胞循环CD34+内皮祖细胞，内皮细胞CD34+, Flk-1+内皮祖细胞CD34+, Flk-1+,AC133 +培养内皮细胞CD34+, Flk-1+,AC133本课题受国家“十五“211工程重点学科建设基金资 助参加本课题的研究人员乐 飞 张国平 王新红 梁光波 张 威 史连国 曲晓义 钱睿哲Thanks！Thanks！Angiogenesis inducible factors: VEGF etc. To stimulate prol