犬骨髓CD34+细胞种植人工血管置换后短期内皮化的实验研究

1、犬骨髓CD34+细胞种植人工血管置换后短期内皮化的实验研究【摘要】目的：讨论骨髓D34+细胞种植于常用膨体聚四氟乙烯expandedplyteraflurethylene，ePTFE人工血管和涤纶人工血管后二者的内皮化程度。方法：选杂种犬8条，依支架覆膜不同分为ePTFE组和涤纶组，每组实验犬2条，对照犬2条。实验犬采自体骨髓，提取D34+细胞种植覆膜支架，对照犬采用单纯自体血预凝覆膜支架。将人工血管植入犬的下腔静脉和腹主动脉。在术后第10、30天观察植入的人工血管通畅情况，采用免疫组织化学方法鉴定内膜细胞来源，在光镜和电镜下观察人工血管新生内膜外表内皮化情况。结果：术后第10天实验组与对照组

2、差异无统计学意义；术后第30天腔面新生内膜内皮细胞自人工血管吻合口向中间逐渐减少P0.05；而对照组内膜外表第10、30天均无内皮细胞覆盖。结论：经纯化的D34+细胞种植于ePTFE和涤纶人工血管,均获得理想的内皮化。【关键词】人工血管D34血管内膜【ABSTRAT】bjetive:TinvestigatetheendthelializatinfartifiialbldvesselseededbyD34+steells.ethds:Eightrssbreddgsererandizedinttgrups.ArtifiialbldvesselveredithePTFErDarnereiplante

3、dinttheabdinalartaarteryAAAandinferirvenaavaIV.Ineahgrup,tdgsereiplantedbyprsthesesseededbyD34+steells,tdgsereiplantedbyautgenusbldnlyasntrl.Theprsthesesereexplantedattenrthirtydays.Lightandeletrnirspyereapplyedtexaineendthelializatinfprstheses.D34fatrstainereusedtidentifyendthelialells.Result:nflue

4、ntendthelialellsappearedntheneintiafseededprstheses.Thereerenendthelialellsinthen-iplatedprstheses.nlusin:RapidendthelializatinanbeahievedintheprsthesesveredithePTFErDarnhihareiplantedbyD34+steells.TheeffetfDarnsendderisiplantedbyD34+steellsisbetterthanePTFEs.【KEYRDS】BldvesselprsthesisD34Tuniaintia人

5、工血管作为一种非生物材料，其近远期通畅率是血管外科医师最关心的问题。资料统计人工血管重建膝下动脉的5年通畅率仅为38.9%。有研究说明以提纯的骨髓D34+细胞种植人工血管具有较高的特异性，可以明显进步人工血管新生内膜的质量和数量，防止了新生内膜钙化灶的形成，大大改善了患者的远期预后。国内已有学者从骨髓和脐血中获得内皮细胞祖细胞，经体外诱导成内皮细胞，短期培养扩增后用于人工血管内皮化的研究。本研究以骨髓D34+细胞种植目前临床常用的两种小口径6人工血管膨体聚四氟乙烯expandedplytetraflurethylene,ePTFE和涤纶人工血管，替代实验犬的腹主动脉和下腔静脉，观察短期内腔面内

6、皮细胞覆盖情况,为寻求一种具有抗血栓和抑制新生内膜增生的半生物化人工血管提供实验根据。1材料与方法1.1实验动物济南地区杂种犬8条,雌雄不限,体质量15.81.4kg，犬龄12岁。随机分为ePTFE组和涤纶组，每组4条，包括实验犬2条和对照犬2条。1.2D34+细胞的别离戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉,无菌条件下穿刺犬髂后上嵴，成功抽取骨髓1520L，置入肝素预处理的无菌试管内。PBS稀释后以1.077Fill提取单个核细胞，调整细胞浓度2107L-1。PE标记抗犬D34单克隆抗体购自BD生物，批号：BD550427与D34+磁珠结合，移入免疫磁珠别离系统德国美天旋公司消费，型号：BD5578

7、12，获取D34+细胞，送流式细胞仪鉴定，4冰箱过夜手术备用。1.3人工血管预凝取长3、外径6的ePTFE和涤纶人工血管各2条。于前肢抽取犬静脉血8L，别离血浆。每只人工血管加0.8L血浆与0.1L2.5%氯化钙溶液，两端夹闭轻轻旋转混匀5in预凝血管。开放一端，倾出混合液。实验犬用人工血管内再注入别离的0.5LD34+细胞与对倍1L自体血浆、2.5%氯化钙的混合液，以2r/in速度缓慢旋转20in，倾出混合液。对照犬用人工血管不做此处理。所有人工血管均移至加有PBS的无菌培养皿中，置于冰上手术备用。1.4人工血管植入犬戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上。无贱条件下翻开腹腔，解

8、剖后腹膜，暴露并别离肾下腹主动脉段35，近、远端置橡胶牵引带。肝素0.6g/kg静脉推注，无损伤血管钳阻断腹主动脉近、远端，中间离断，间置入ePTFE或涤纶血管，以5-0prlene缝线两点法行端端吻合后开通血管，观察吻合口处有无漏血、腹主动脉搏动是否良好。别离同一程度段下腔静脉。同样方法间置入ePTFE或涤纶血管。术中静脉给予液体500L，青霉素80万U。术后每天青霉素80万U肌肉注射，连续3d；阿司匹林300g随水饮，持续1周。每天观察犬手术肢体皮色、皮温、运动情况，股动脉搏动情况，后肢及腹壁静脉充盈情况。1.5人工血管检测分别于术后第10和第30天处置两组实验犬和对照犬各1条。麻醉方法同

9、前,显露移植的人工血管,观察外形和通畅情况。切取人工血管及相连的局部自体血管管壁,迅速肝素化后纵向剪开，观察管腔有无狭窄、腔面是否光滑、有无血栓附着和新内膜覆盖情况。留取标本行HE染色、免疫组织化学及电镜检测。2结果2.1D34+细胞的鉴定锥虫蓝染色，流式细胞仪鉴定，由骨髓别离获得的D34+细胞，活细胞数量为2.60.3107L-1图1。2.2手术及术后情况术中吻合口对合良好，无渗血，动脉可触及明显搏动，静脉充盈满意，术后2h犬可正常站立。2.3组织标本的大体观所有植入的人工血管均无明显的外压变形，与周围组织粘连较严密。纵行剖开腔面，术后第10天取材的人工血管内局部腔面覆盖新内膜，且距吻合口越

10、近新内膜越完好，流入道吻合口较流出道吻合口处完好，管腔内未见血栓附着，血管腔面光滑，吻合口无组织增生。实验犬与对照犬无明显差异。术后第30天实验组的人工血管内腔面完全覆盖新内膜,外表光滑,呈半透明状,未见血栓附着，管腔无狭窄图2。2.4光镜观察光镜下可见第30天两组实验犬动脉人工血管的新生内膜组织细胞排列有序，其腔面为扁平的内皮细胞层，混有少量纤维素和血细胞混合物，内皮细胞层外为纤维母细胞、胶原和平滑肌细胞等。涤纶血管新生内膜贴附腔面严密且完好，ePTFE血管新生内膜与血管腔面间有局部别离图3。2.5免疫组织化学检测两组实验犬和对照犬的人工血管均行D34抗原染色，第30天实验犬血管内膜见内皮细

11、胞层呈棕黄色染色图4。2.6扫描电镜观察第10天的实验犬人工血管电镜扫描可见：内皮细胞自吻合口向人工血管爬行，内皮细胞密度逐渐减少，其间见纤维蛋白和少量血细胞附着，局部区域可见散在分布呈梭形及正向梭形演变的内皮细胞。第30天ePTFE组实验犬人工血管电镜扫描示：吻合口处出现大量新生内皮细胞，沿血管轴向排列；细胞密度向人工血管中段逐渐减少,局部区域可见片状分布的内皮细胞图5。第30天两组对照犬人工血管内膜外表无内皮细胞覆盖，仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列。转贴于论文联盟.ll.3讨论人工血管的诞生为血管外科的开展提供了必要的条件，已广泛应用于全身各个部位。目前大中口径人工血管替代人体大中

12、动脉已获成功,但对血管内径6或血流速度较低的小动静脉,人工血管替代一直未能获得满意的效果4，常常由于血栓形成和新生内膜增厚导致人工血管闭塞而使移植失败。近年来，小血管重建仍多采用自体血管移植。然而，由于自体可供采集的血管数量有限，且需考虑患者自身原因,所以研制一种优良的小口径血管替代品就显得尤为重要。人工血管首先要考虑制造材料的生物相容性和生物稳定性。目前应用最多的人工血管材料有天然真丝、涤纶和ePTFE，其中ePTFE的使用率最高。然而临床资料显示,自体血管移植物2年后的通畅率可达75%,而ePTFE人工血管移植物的仅为30%。1978年Herring等首先报道了内皮细胞种植技术,开拓了人造

13、血管内皮化的新途径。Zilla等用同源的血清成团培植出内皮细胞，使内皮细胞种植人工血管得到较广泛研究。Nishiki等将犬自体骨髓移植于ePTFE人工血管置换腹主动脉，发现其内膜增生在一定程度上减轻。Bhattaharya等认为提纯的骨髓D34+细胞种植人工血管比以骨髓种植的人工血管具有较高的特异性。Bhattaharya等将骨髓D34+细胞种植到聚乙烯管Plyethylenetute,PET材料的人工血管上，内皮化面积明显大于未种植人工血管92%3.4%vs26.6%7.6%。大多学者认为D34+细胞是造血干细胞和内皮祖细胞的共同祖先细胞。在体外一定的条件下,内皮祖细胞能被诱导而分化、增殖、

14、迁移并形成血管。正常人D34+细胞在骨髓低密度单个核细胞中约占1.5%1%3%，在脐带血中为0.2%0.5%，外周血中含量约为骨髓的1/10，因此骨髓和脐血是提取D34+细胞的理想来源。近几年国内已开展了从骨髓和脐血中获得内皮细胞祖细胞、经体外诱导成内皮细胞、短期培养扩增后用于人工血管内皮化的研究。多项研究显示，D34+细胞在种植人工血管进展人工血管内皮化方面已显现出宏大的潜能,有望取代成人血管种子细胞而成为最理想的组织工程血管细胞-。本研究发现骨髓D34+细胞种植的涤纶和ePTFE人工血管均可快速的内皮化。实验犬第10天即可见内皮细胞自吻合口向人工血管爬行，第30天腔面新生内膜细胞密度从人工

15、血管自吻合口向中间方向逐渐减少；而对照犬内膜外表无内皮细胞覆盖。免疫组织化学结果和电镜微观构造观察均证实为内皮细胞。涤纶人工血管D34+细胞种植后贴附腔面程度和内皮化效果优于ePTFE人工血管，考虑涤纶人工血管本身孔隙较大，自体血管中的内皮细胞可能透过孔隙进入腔面，而对照犬那么无明显的内皮细胞覆盖，提示D34+细胞种植人工血管能较好的内皮化，为临床长期应用提供了实验支持。【参考文献】1riE,KriK,Kue,etal.parisnfthelng-terresultsbeteensurgialandnservativetreatentinpatientsithinterittentlaudia

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